田口 良（東京大学 大学院医学系研究科 客員教授）
脂質メタボロームのための基盤技術の構築とその適用
平成17年度 平成18年度 平成19年度
§1．研究実施の概要
代謝物質を動的・包括的に解析するメタボローム研究が、生命現象や生体機能調節を解明する上で重要であると考えられる様になってきている。このメタボロームの対象分子の中で脂質分子は細胞内外の情報伝達において主要な役割を演じており、生命活動や病態を本質的に理解する上で鍵となる重要な分子群と考えられるようになってきた。本研究では、生命活動に伴う脂質関連代謝分子の変動について、網羅的・包括的に質量分析データを取得して解析する基盤技術を構築することを目的とする。さらには、個別の脂質研究にこの基盤技術を適用して解析することにより、脂質メタボロームのリアルデータベースの作成、未知の代謝産物や代謝経路の発見を通じて、細胞機能の有益な制御を目指す。
田口グループはこれまでに構築した脂質メタボローム解析手法を基に、特に通常の手法では検出が困難であることが判っていた微量酸性リン脂質、酸化脂質について、高感度検出法を検討し、非常に高感度な測定手法を確立した。現在、リン脂質、中性脂質、酸性リン脂質、これらの酸化体、セラミド糖脂質等について、標準的な抽出条件や特異的解析法を確立し、これらを、肥満と各種炎症モデルマウスの解析に適用し、動脈硬化、心筋梗塞等の病態モデルにおいて、高度不飽和脂肪酸を持つ分子種を中心とした脂質代謝の異常が非常に高感度で測定できることが確認した。今後、マイクロダイセクションによる部位特異的解析とこれらの高感度解析法を組み合わせ、脂質分子種の局在とその生理的、病理的機能を解析してゆく予定である。
花田グループはセラミドの小胞体からゴルジ体への細胞内輸送を担う蛋白質CERTの機能がリン酸化によって負に制御されていることを明らかにした。横溝グループは田口グループと共同でGPCRの一つBLT2の新たなリガンドを発見し、その構造を決定した。久下グル－プは新規ホスホリパーゼDが、リン脂質のミトコンドリアへの輸送に関与する可能性を示した。小林グループは、病態モデルとして出血性ショックモデルラットに着目し、リン脂質を中心としたリピドーム解析を適用して脂質メディエーターを見出した。横山グループは極長鎖脂肪酸を結合した異常なグリセロリン脂質を、生合成・蓄積することにより致死となる分裂酵母の変異株で、90kDaのタンパク質が発現することを見いだした。福崎グループは脂質メタボローム解析ツールの種々の改良を行った。
§2．研究実施内容
質量分析によるデータから脂質代謝物を同定するためのLipid Search自動同定システムの改訂版を2006年11月に公開したが、この検索による同定効率を高めるためにLC/MSにおける溶出時間をスコアリングに活用する為の改良を行った。また、開発した自動定量プロファイリングシステムとlipid Searchの自動検索結果を統合できる解析システムのテスト版が出来た。今後実際の測定サンプルに適用してさらにその改良を行う。現在すでにほぼ終えているマウスの臓器毎のリン脂質等に関するリアルデータベースの公開はシステムの完成を待って20年度秋頃を目指す。
田口グループ:脂肪酸のアシル化反応の特異性について、メタボローム解析により、いくつかの新しい機能を解明した（田口1,2）。また、HPLCによる分離、定量が困難であったホスファチジン酸やホスファチジルセリン等の酸性リン脂質について質量分析による高感度測定手法を確立できた（田口3）。18年度に確立した酸化脂質の測定法をもちいて、19年度に、炎症や酸化ストレスに連動して起こる脂質代謝変化とともに、微量酸化脂質、酸化リン脂質を実際に検出できた（投稿準備中）。今後は検出した酸化脂質をさらに詳細に解析し、炎症とその緩解期における対象として測定する。また、19年度はレーザーマイクロダイセクションの新たな導入により10ミリミクロンの厚さで1mm四方の組織サンプルからほとんどのリン脂質分子種の分析が可能であることが判り、炎症部位等の組織局部における高度不飽和脂肪酸含有リン脂質分子種の特異的変動が観察できた（投稿準備中）。
花田グループ:哺乳動物細胞におけるスフィンゴ脂質代謝分子メカニズムの解明に向けて、本年度は、細胞内セラミド輸送の制御メカニズムについて解析を進めた。そして、セラミドの小胞体からゴルジ体への細胞内輸送を担う蛋白質CERTの機能がリン酸化によって負に制御されていることを明らかにした（花田１）。
横溝グループ：BLT2はロイコトリエンB4によって活性化されるが、高濃度のロイコトリエンB4が必要なため、他の生体内リガンドが存在することを想定し、横溝グループと田口グループが協同で高親和性リガンドの同定を試みた。ラットの様々な臓器より脂質抽出を行い、BLT2過剰発現細胞に添加してBLT2の活性化能を検討した。小腸から抽出したアセトン可溶性の脂質画分をHPLCにて展開したところ、LTB4とは異なるフラクションにBLT2活性化能を検出し、これを精製・質量分析系にて構造を決定したところ、12-HHT(12(S)-Hydroxyheptadeca-5Z, 8E, 10E-trienoic acid)であることがわかった。これまで12-HHTはトロンボキセンA2産生に伴うバイプロダクトであり生物活性は無いと考えられてきたが、強力なBLT2活性化能を有する新規生理活性脂質であると考えられた(横溝2, Okuno, J. Exp. Med.)。
久下グループ：リン脂質の細胞内輸送と分子種との関連を酵母変異株のメタボローム解析で明らかにする目的で、リン脂質の細胞内輸送に関与する遺伝子の同定を試みた。その結果、新規ホスホリパーゼDが、リン脂質のミトコンドリアへの輸送に関与する可能性が示唆された（久下１）。リン脂質の細胞内輸送と分子種との関連を酵母変異株のメタボローム解析で明らかにする目的で、リン脂質の細胞内輸送に関与する遺伝子の同定を試みている。今回、新規ホスホリパーゼD（PLD3と命名）が、ホスファチジルセリン脱炭酸酵素１と遺伝学的に相互作用し、両者が欠損すると酵母は増殖損傷を示し、カルジオリピン（CL）の含量が著しく低下することを見出した。CL合成には、その前駆体であるホスファチジン酸のミトコンドリアへの輸送が必要であり、今後、この過程を含めPLD3がCL合成のどの過程に関与するのかを明らかにしたい。
小林グループ：昨年度に確立した、イオン化効率を高めた誘導体化法を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析（QTRAP）測定方法について、更に多様なステロイド化合物への適用を検討し、分子イオンやフラグメントイオン情報を集積した。また、細胞への熱ストレスに伴って誘導されるステロール誘導体の機能について、本手法を応用して解析し、合成酵素の性状を明らかにしつつある。一方、その他の生理活性脂質についても、病態モデルとして出血性ショックモデルラットに着目し、リン脂質を中心としたリピドーム解析を適用して脂質メディエーターを見出した（小林1）他、軟体動物中にユニークな構造を有するスフィンゴミエリンを同定した。
横山グループ：極長鎖脂肪酸を結合した異常なグリセロリン脂質を、生合成・蓄積することにより致死となる分裂酵母の変異株で、90kDaのタンパク質が発現することを見いだし、J. Biochem.誌に発表した（横山1）。また、マウス腹腔マクロファージにコレステロール＋ホスファチジルセリン含有リポソームを与えるとlipid dropletを形成するが、この動脈硬化モデルにおいてリポソームを構成するグリセロリン脂質のアシル鎖をさまざまに変えて、脂肪滴形成と脂質代謝について検討した。その結果、オレイン酸では脂肪滴が形成され、コレステリルエステルも合成されて泡沫化が起こった。しかしパルミチン酸やステアリン酸などの飽和脂肪酸では泡沫化は起こらずアシル鎖選択性があることがわかった。
田口グループと高橋グループとが共同で進めてきたFTICRMSによる精密質量分析に関しては、質量分析メーカーの協力も仰ぎ、酸化ホスファチジルコリンを中心とした酸化リン脂質について、ほぼフラグメントの元素組成レベルでのフラグメント解析を行うことが出来た。
福崎グループ：メタボローム解析ツールの改良を行った。まず、これまでに確認された問題点の原因として、読み込み可能な分子種が制限されているのはあらかじめ作成した分子種リストと比較しながら化合物リストを作成する手法を取っていた為であり、サンプルや分析条件が変わって分子種が増えると増えた分の分子種に対応できず、データが読み込めなかった。そこで、読み込んだ全てのファイルから分子種の種類を読み込み、分子種リストを一時ファイルとして自動作成し、これと比較することで化合物リストを作成するように改良した。また、主成分分析の結果が上下、左右で反転する原因としては、主成分分析のローディングを求める際に分散共分散行列の固有ベクトルを計算することとなるが、束縛条件がノルムが１であるというだけであるため、全ての符号が反転したベクトルも条件を満たしてしまい、その結果、主成分のスコアが反転する現象が起きていた。そこで、さらに束縛条件としてベクトルの第一要素が正の値であるという条件を追加し、問題を解決した。また、主成分分析のスコアだけでなく、ローディングについても表示出来るように改良を加えた。今後は他の脂質解析ソフトとのデータフォーマットの統合を行っていきたいと考えている。
§3．研究実施体制
（1） 「田口・花田」グループ ① 研究分担グループ長： 田口 良（東京大学大学院、客員教授）
② 研究項目
・ 脂質メタボロームのための基盤技術の構築とその適用
（2） 「花田」グループ（田口グループ内）
① 研究分担グループ長： 花田 賢太郎（国立感染症研究所、部長）
② 研究項目
・脂質代謝物に関するデータベースを利用したスフィンゴ脂質の代謝制御と機能の解析の解明 |
（3） 「横溝」グループ
① 研究分担グループ長： 横溝 岳彦（九州大学、教授）
② 研究項目
・ 脂肪酸及びその誘導体に関するデータベース構築と機能解明
（4） 「久下」グループ
① 研究分担グループ長： 久下 理（九州大学、教授）
② 研究項目
・ 酸性リン脂質及びその代謝物に関するデータベース構築
・ ホスファチジルセリンとその関連リン脂質の代謝と機能解明
（5） 「小林」グループ
① 研究分担グループ長： 小林 哲幸（お茶の水女子大学、教授）
② 研究項目
・ ステロイド関連代謝物のデータベース構築、およびその他生理活性脂質のメタボローム解析 |
（6） 「横山」グループ
① 研究分担グループ長： 横山 和明（帝京大学、准教授）
② 研究項目
・ 極長鎖脂肪酸を結合した異常なグリセロリン脂質を、生合成・蓄積することにより致死となる分裂酵母の変異株で、90kDaのタンパク質が発現することを見いだし、J. Biochem.誌に発表した。 |
|
・ マウス腹腔マクロファージにコレステロール＋ホスファチジルセリン含有リポソームを与えるとlipid dropletを形成する。この動脈硬化モデルにおいてリポソームを構成するグリセロリン脂質のアシル鎖をさまざまに変えて、脂肪滴形成と脂質代謝について検討した。その結果、オレイン酸では脂肪滴が形成され、コレステリルエステルも合成されて泡沫化が起こった。しかしパルミチン酸やステアリン酸などの飽和脂肪酸では泡沫化は起こらずアシル鎖選択性があることがわかった。 |
（7） 「福崎」グループ
① 研究分担グループ長： 福崎 英一郎（大阪大学、教授）
② 研究項目
・ データマイニングシステムの開発
・ 親水性代謝産物のメタボロミクス解析系の開発
(8) 「高橋」グループ
① 研究分担グループ長： 高橋 勝利（産業技術総合研究所、主任研究員）
② 研究項目
・ 脂質メタボロームのための高精度質量分析技術の開発
§4．成果発表等
1) 原著論文発表
田口グループ
- Shindou H, Hishikawa D, Nakanishi H, Harayama T, Ishii S, Taguchi R, Shimizu T. A single enzyme catalyzes both PAF production and membrane biogenesis of inflammatory cells: cloning and characterization of acetyl-CoA:lyso-PAF acetyltransferase. J Biol Chem. 282, 6532-6539, 2007
- Hishikawa D, Shindou H, Kobayashi S, Nakanishi H, Taguchi R, Shimizu T., Discovery of a lysophospholipid acyltransferase family essential for membrane asymmetry and diversity. Proc Natl Acad Sci USA.; 105(8):2830-5. 2008
- Ogiso H, Suzuki T, Taguchi R., Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection. Anal Biochem.; 375(1):124-31. 2008
- Tsumoto H, Murata C, Miyata N, Kohda K, Taguchi R. Efficient identification and quantification of proteins using isotope-coded 1-(6-methylnicotinoyloxy) succinimides by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom.; 21(23):3815-24, 2007
- Okuno T, Iizuka Y, Okazaki H, Yokomizo T, Taguchi R, Shimizu T: 12(S)-Hydroxyheptadeca-5Z, 8E, 10E-trienoic acid is a natural ligand for leukotriene B4 receptor 2. J. Exp. Med. In press
花田グループ
- Keigo Kumagai, Miyuki Kawano, Fumiko Shinkai-Ouchi, Masahiro Nishijima, and Kentaro Hanada: Inter-organelle trafficking of ceramide is regulated by phosphorylation-dependent co-operativity between the PH and START domains of CERT. J. Biol. Chem., 282, 17758-17766, 2007
横溝グループ
- 1. Ando, K., Kawamura, Y., Akai, Y., Kunitomo, J., Yokomizo, T., Yamashita, M., Ohta, S., Ohishi, T., Ohishi, Y*. Preparation of 2-, 3-, 4- and 7-(2-alkylcarbamoyl-1-alkylvinyl)benzo[b] furans and their BLT(1) and/or BLT(2) inhibitory activities. Org. Biomol. Chem. 6, 296-307, 2008
- 2. ＊Okuno T, Iizuka Y, Okazaki H, Yokomizo T*, Taguchi R, Shimizu T: 12(S)-Hydroxyheptadeca-5Z, 8E, 10E-trienoic acid is a natural ligand for leukotriene B4 receptor 2. J. Exp. Med. In press
小林グループ
- 相星淳一、小池薫、小林哲幸、大友康裕、山本保博 (2007) 出血性ショックに続発する多臓器不全のメカニズム－ 腸間膜リンパ液に対する保存血および代用血液の影響－ 日本腹部救急医学会雑誌、27 (1): 51-57.
- Yoko Nagasako-Akazome, Tomomasa Kanda, Yasuyuki Ohtake, Hiroyuki Shimasaki and Tetsuyuki Kobayashi (2007) Apple polyphenols have an influence on fat metabolism in healthy subjects with relatively high body mass index. Journal of Oleo Science, 56 (8): 417-428.
横山グループ
- １． Yokoyama K, Nakagawa M, Satoh M, Saitoh S, Dohmae N, Harada A, Satoh N, Karasawa K, Takio K, Yanagida M, Inoue K. Expression of a Novel 90-kDa Protein, Lsd90, Involved in the Metabolism of Very Long-chain Fatty Acid-containing Phospholipids in a Mitosis-defective Fission Yeast Mutant. Journal of Biochemistry、 143巻、3号、369-375ページ、2008年
福崎グループ
2) 特許出願
① 平成19年度特許出願内訳（国内 ０件）② CREST研究期間累積件数（国内 ０件）
3) その他
① その他の成果発表すでに公開中の脂質メタボローム自動検索システムについて、 http://lipidsearch.jp/LipidNavigator.htm 上にフラグメントによるスコアリングを加味したlipid Searchの改訂版を公開した（２００７年１１月）。なお、２００８年５月にLCの溶出時間をスコアリングに加えた改訂版を公開する予定である。 |
