田口 良（東京大学 大学院医学系研究科 客員教授）
脂質メタボロームのための基盤技術の構築とその適用
平成17年度 平成18年度 平成19年度
§1．研究実施の概要
ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームの進展に伴い、メタボローム解析の重要性が叫ばれている。すなわち、生命現象を直接担っている分子は、遺伝子産物であるタンパク質によって合成・分解され、結合・運搬される数多くの低分子化合物であり、これらの代謝物質を動的・包括的に解析するメタボローム研究が、生命現象や生体機能調節を解明する上で重要であると考えられる様になってきている。このメタボロームの対象分子の中で脂質分子は細胞内外の情報伝達において主要な役割を演じており、生命活動や病態を本質的に理解する上で鍵となる重要な分子群と考えられるようになってきた。しかし、脂質分子の特性から、タンパク質を中心とした従来の研究手法を直接は適用できない等の制約があるため、重要な脂質機能の多くが未解決で残されている。質量分析を基盤とした脂質メタボローム解析は、この難問を解決する突破口と期待されている。
本研究では、生命活動に伴う脂質関連代謝分子の変動について、網羅的・包括的に質量分析データを取得して解析する基盤技術を構築することを目的とする。さらには、個別の脂質研究にこの基盤技術を適用して解析することにより、脂質メタボロームのリアルデータベースの作成、未知の代謝産物や代謝経路の発見を通じて、細胞機能の有益な制御を目指す。具体的には、I 質量分析手法の開発、II 質量データベース構築と同定・検索ツールの開発、III 定量的可視化ツールの作成、IV 多変量解析ツールの作成、V 各脂質代謝系への適用とリアルデータベースの構築、の5項目について順次進めていく予定である。
§2．研究実施内容
今年度は上記の実験項目の内、IとIIの項目を重点にすすめ、Vの脂質代謝系への適用に関しての予備実験を開始した。
田口グループでは、I 脂質メタボローム解析に適した、質量分析解析手法の開発と、II 脂質メタボロームの為の質量データベース構築と同定・検索ツールの開発、を重点的に取り組んだ。
まず、I 質量分析解析手法の開発を考える上で、脂質メタボローム解析の基盤技術として最も重要なことは、最新の質量分析技術を脂質に適用する手法の確立である。本研究では、四重極、イオントラップ、飛行時間型、フーリエトランスフォーム型の各種質量分析計を駆使して多様な脂質分子を分析し、最適な測定条件を決定することを検討した。その結果、以下に上げるa)、b)、 c)の３種類の特徴の異なる手法をほぼ確立した。a) 網羅的、包括的解析 --特定の分子群に限定せずに、LCにより分離溶出された分子を、イオン強度の高い順にできるだけすべてMS/MSを用いて分析するという包括的な手法である。リン脂質のメタボローム解析に順相又は逆相LC-MSを用いた場合、ほぼ1時間程度の溶出時間の条件下で、各リン脂質のクラス、サブクラス100-200程度の分子種同定が可能である事が判った。 b) 特定の分子群にフォーカスした手法--グループ特異的な、フォーカスドメタボロームとも呼びうる同定法である。トリプルステージ型質量分析計のMS/MS分析を利用した、重要な解析手法としてプレカーサーイオンスキャン(precursor ion scanning) やニュートラルロススキャン(neutral loss scanning)が挙げられる。この手法は、リン脂質の各クラスを特異的かつ網羅的に同定するために用いる事が出来る。また特定の脂肪酸を持つ分子種を選択的に同定する事が可能な手法でもある。c) 特異的な代謝物にターゲットを定めた手法--特定のクラス内の特定分子種分子を対象とした個別かつ特異的同定法である。selected reaction monitoring (SRM) またはmultiple reaction monitoring (MRM)と呼ばれる手法である。特定のMS値のみをスキャンするために、検出感度が高く、定量法としても用いることが出来る。非常に微量しか存在しない代謝成分の同定法として有効であることを確認した。構造的に存在が予想可能な成分に対する仮想的なデータベースを用い、拡張MRMという、部分的に網羅性を加味した手法として確立することを目指して取り組んでいる。この内容についは近々発表の予定である。
2番目の課題であるII 質量データベース構築と同定・検索ツールの開発に関しては、これまで我々が公開していたテキストファイルからの検索同定ツールに加え、2005年11月末にリン脂質について質量分析メーカーの生データから直接、検索・同定が可能なツールを公開した（http://lipidsearch.jp）。さらに、2006年2月にはトリグリセリド等の中性脂質に対する自動解析も可能なバージョンアップを行った。V 個別脂質代謝系への適用に関しては、田口グループでは酸化リン脂質の分析を血漿等を用いて開始した。同様に各個別グループにおいても、以下の取り組みがなされた。
花田グループ
本年度は、細胞内セラミド輸送の制御について解析を進めた。哺乳動物細胞における小胞体-ゴルジ体間セラミド選別輸送を担う蛋白質CERT上の７アミノ酸からなるペプチドモチーフ(FFATモチーフ)が小胞体膜蛋白質VAPとの相互作用、および細胞内セラミド選別輸送に重要であることを明らかにした。
横溝グループ
強力な炎症起炎物質であるロイコトリエンB4(LTB4)の高親和性受容体であるBLT1の生体内での役割を解明する目的で、BLT1欠損マウスを作成し表現型の解析を行った。BLT1欠損マウスから単離した好中球ではLTB4依存性のカルシウム上昇反応、脱顆粒反応が完全に消失していたため、BLT1が好中球において主要なLTB4受容体であることがわかった。 また、BLT1は、抗原感作によるTh2型免疫反応に対して促進的に機能していることが明らかとなった。さらに、全てのプロスタグランディン、ロイコトリエン、ヒドロキシエイコサテトラエン酸、血小板活性化因子を、生体材料から抽出し、一斉に定量する系を確立した。
久下グループ
細胞内には構成脂肪酸が異なる種々のPS分子種が存在する。しかし現在、これらPSの分子種組成がPS代謝のどのレベルで制御されているのかは不明であり、またPSの生理機能とPS分子種の関連もよく理解されていない。本年度は、哺乳動物細胞に存在する２種類のPS合成酵素により生合成されるPS分子種を明らかにする目的で、これら酵素の精製を試みた。その結果、２種類の酵素をそれぞれ部分精製することに成功し、これら酵素が合成するPS分子種特異性を明らかにするための準備が整った。
小林グループ
１）ステロイド関連化合物の質量分析--各種ステロイド、および関連化合物の標準品を用いて、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS、機器名Q TRAP）測定の最適化を行い、質量分析データの取得を試みた。 一方で、ステロイド配当体の一種であるコレステリルグルコシドとその類似体について、TOF-MSを用いて分析する条件を確立し、分子イオン、およびフラグメントイオン情報を集積した。２）その他の生理活性脂質の質量分析 -- ステロイド以外の生理活性脂質として、細胞増殖抑制作用、ガン細胞浸潤抑制作用、及び神経栄養因子作用がある、環状ホスファチジン酸（cPA）のメタボローム解析を行った。その結果、哺乳類血清中のAutotaxinによるcPA生合成機構の一部が明らかになった。
横山グループ
1）細胞周期におけるリン脂質のメタボローム解析のため、HeLa細胞を用いた同調培養の実験系を確立した。予備的に分裂期（Ｍ期）に同調したサンプルのマススペクトル解析を行った。 2）酸化した食用油に含まれる中性脂質の薄層クロマトグラフィーを行なったところ、やや極性の高い酸化した分子種が含まれていることが示唆された。さらに分子種分析を行なう目的でマススペクトル解析をしたところ、通常の食用油成分とは異なる多数のピークが観察された。
福崎グループ
まず、脂質分析のデータとしてマウスのレチナから抽出した脂質をESI/MSで分析したデータを用いた。このデータから、各サンプルに含まれるすべての分子種を網羅的に比較するためのマトリクスデータを作成した。次に、上記マトリクスデータに対して既存のソフトを用いてPCA解析およびBL-SOM解析を行ったところ、生後の日数に応じて側鎖の鎖長や不飽和度が変動していく傾向が見られたものの、データ量が多くなりすぎ、詳細なデータの考察をするには不向きであることが問題点として挙げられた。そこで、今年度の研究計画でも報告したようにリン脂質の解析データを表示するための専用ブラウザの開発を行うことを今後の予定とした。
高橋グループ
標準脂質及び脂質代謝物の高分解能・高精度質量分析及びMS/MS測定を行うために、FTICR-MS環境の整備を実施した。具体的は、１）4T-Q-FTICR-MSへのNanoESIソースの導入と最適化、及び ２）NanoLCシステムとの連結を実施した。しかし、これを実施するために、大気圧インターフェイスのアップグレードが必要であるとの結論に達し、準備を行った。
§3．成果発表等
論文（原著論文）発表
田口グループ
- Toshiaki Houjou, Kotoko Yamatani, Masayoshi Imagawa, Takao Shimizu, Ryo Taguchi. A Shotgun tandem mass spectrometric analysis of phospholipids with normal-phase and/or reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mss spectrometry.: Rapid Commun. Mass Spectrom., 19, 654-666 (2005)
- Taguchi R, Houjou T, Nakanishi H, Yamazaki T, Ishida M, Imagawa M, Shimizu T. Focused lipidomics by tandem mass spectrometry.: J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 25;823(1):26-36 (2005)
横溝グループ
- Terawaki K, Yokomizo T, Nagase T, Toda A, Taniguchi M, Hashizume K, Yagi T, Shimizu T. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2 type immune responses. J. Immunol. 175, 4217-4225, 2005
- Yoshikawa K, Kita Y, Kishimoto K, Shimizu T. Profiling of eicosanoid production in the rat hippocampus during kainate-induced seizure: Dual-phase regulation and differential involvement of cox-1 and cox-2. J. Biol. Chem. 2006 (in press, DOI: 10.1074/jbc.M511089200)
小林グループ
- Satomi Tsuda, Shinichi Okudaira, Keiko Moriya-Ito, Masayuki Tanaka, Junken Aoki, Hiroyuki Arai, Kimiko Murakami-Murofushi, and Tetsuyuki Kobayashi (2006) Cyclic phosphatidic acid is produced by autotaxin in blood. J. Biol. Chem., in press.
福崎グループ
- Fukusaki, E., K. Jumtee, T. Bamba, T. Yamaji, and A. Kobayashi, "Metabolic Fingerprinting and Profiling of Arabidopsis thaliana Leaf and its Cultured Cells T87 by GC/MS." Z Naturforsch [C]: in press.
- Bamba, T., Fukusaki, E., Minakuchi, H., Nakazawa, Y., and Kobayashi, A.: Separation of polyprenol and dolichol by monolithic silica capillary column chromatography. J Lipid Res, 46, 2295-2298 (2005)
