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平尾　敦　（金沢大学　がん研究所　教授）

代謝解析による幹細胞制御機構の解明

平成17年度　　平成18年度　　平成19年度

§1．研究実施の概要

本研究は、恒常的に、あるいは障害時に細胞の供給源となる組織幹細胞を対象に、細胞内代謝の観点からその制御システムを理解することを目標とする。また、正常組織幹細胞に加え、がん組織の中の幹細胞的な役割を持つ“がん幹細胞”も研究の対象とし、幹細胞研究の技術・知識を基盤とするアプローチによって、がんの発生・維持の制御機構を解明することを目標とする。本研究成果をもって、再生医療における技術向上あるいは新しいがん治療の開発に貢献し、社会へ還元することを目指すものである。本年度は、H19年度の研究実施計画に基づき、下記のように研究を遂行した。
　まず、昨年までの研究の成果によって代謝制御分子・フォークヘッド転写因子FOXO、細胞周期チェックポイント分子ATMが幹細胞システムの維持において必須の役割を担っていることが判明したため、本年度は引き続きその分子メカニズムを理解することを目的に解析を行った（平尾グループ）。その結果、FOXOの機能の一つとして、活性酸素制御における役割が明らかとなった。FOXOの直接の標的として、MnSOD, Catalaseなどの抗酸化酵素があげられ、活性酸素上昇が幹細胞機能に影響していることが示唆された。さらに、FOXOの活性化に伴う代謝産物変化の解析を行ったところ、グルコース代謝経路を抑制的に調節していることが示唆された（合田グループ）。一方、ATMに関して、造血系、神経系に加え、生殖系列においてもその重要性を明らかにした。その結果、その制御メカニズムは、それぞれ、活性酸素、テロメア制御、p53-p21経路であり、直接の作用標的は様々であることが判明した。しかしながら、これらの要素はすべてゲノムDNAを不安定にするものであるということ、さらには幹細胞レベルでのDNA損傷が加齢による組織恒常性の破たんを導くとい観点からは、ある種の共通性の存在を示唆するものであった。また、造血幹細胞における低酸素応答に関して、超長期BrdU保持細胞が低酸素マーカーPimonidazole陽性であることを見出した（須田グループ）。このことは、造血幹細胞維持にとって低酸素応答の重要性を示唆する所見であり、今後、低酸素応答因子HIF1の造血幹細胞における役割を明らかにすることによって、幹細胞機能と代謝制御の接点を理解できることが期待される。
　がん組織の解析において、primaryの神経幹細胞を用いた脳腫瘍モデルの構築を試みた(平尾グループ)。このモデルでは、主に生体環境において腫瘍を発生させることによって、腫瘍の中での未分化細胞から分化する過程を再現することができ、がん幹細胞の分化プロセスを標的にした治療ターゲットの特定に有用なモデルであることが判明した。一方、この腫瘍組織の代謝産物を解析した（合田グループ）。多くのアミノ酸の変動が観察されアミノ酸輸送体を介して細胞増殖に必要なエネルギーやタンパク質合成を維持していることが示唆され、癌における特殊な代謝制御が観察された。岩間グループは、昨年度までの肝臓がん細胞株における幹細胞の解析に加え、肝臓がんおよび白血病におけるBmi-1の機能を解析し、田賀グループは、がん幹細胞制御機構との共通性という観点から、胎生期造血幹細胞と神経幹細胞の解析を行った。

§2．研究実施内容

■平尾グループ

　1）幹細胞と代謝

造血幹細胞の自己複製、未分化性維持あるいはストレス応答に重要な代謝制御分子フォークヘッド転写因子FOXO3aの機能解析に取り組んだ。FOXOは、線虫の寿命制御分子として知られる転写因子Daf-16のオルソログであり、この分子がマウス造血幹細胞の細胞周期、特にG0期維持、骨髄再構築能に必須の役割を持つことを明らかにした（論文１）。FOXOは、転写因子であるため、その標的分子の探索を行った。まず、FOXO欠損造血幹細胞において、DCFDAにより活性酸素種の上昇が確認されたため、活性酸素上昇の分子機構を明らかにする目的で、FOXO3a欠損造血幹細胞と野生型コントロール細胞を用い、遺伝子発現をマイクロアレイにて解析した。その結果、MnSOD, Catalaseなどの抗酸化酵素の発現が低下していることが判明した。これらの抗酸化酵素は、FOXOの直接的ターゲットとして知られているため、活性酸素制御機構としての役割が示唆された。また、活性酸素制御と造血幹細胞制御に重要な役割をもつATMもその発現が低下していた。ATMに関しては、直接の標的か二次的な反応の結果によってもたらされたものかは不明であるが、幹細胞制御への関与が示唆された。ATMは、造血系のみではなく、精子幹細胞においてもその組織再構築能に必須の役割があることを見出した（論文2）。また、最近、他のグループから、FOXO3aの欠損が神経幹細胞の加齢とともに減少することが見出されたが、本研究での成果と合わせると、代謝制御分子FOXOの組織を超えた共通の幹細胞レベルでの制御機構の存在が示唆された。FOXOは、造血系細胞の中でも、未分化な細胞と分化した細胞との間で、その生存、増殖における役割が違うことが観察され、今後その標的分子の違いも明らかにすることによって、幹細胞機能の維持向上のための技術開発に寄与できるよう研究を推進する必要がある。
　一方、様々な幹細胞で、共通に高く発現する分子の検索をし、いわゆる”Stemness”の理解と代謝制御の関係に取り組んだ。その候補として、核小体蛋白であるヌクレオステミンの発現制御と機能解析について検討した。胚性幹細胞を免疫染色法によって、未分化な状態では高い発現を示すのに対して、レチノイン酸により分化誘導することにより、内在性の発現が低下することを確認した。また、この分子は核小体に局在していること、shRNAによってノックダウンすると、タンパクの翻訳の機能不全により、その増殖能の低下を示すことが判明したため、幹細胞の組織再生能に必須の分子であると考えられた。また発現制御を解析するため、プロモーターによるGFP発現系を用いて幹細胞における制御を解析した。その結果、胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞において、共通して高いプロモーター活性をもつことが判明し、幹細胞可視化システムの構築が可能であることが示唆された。一方で、毛胞細胞の再生過程、神経上皮の制御の研究を同時に進め、様々な組織の再生能力の理解の基礎を固めた。

　2）がんと代謝

がん組織の中の幹細胞の性状の理解と代謝制御との関係を明らかにするため、様々な組織の腫瘍モデルの構築に取り組んだ。本年度は、特に神経組織由来悪性腫瘍の作成を試みた。p16INK4a/p19Arf欠損マウス由来、神経幹細胞を分離し、ニューロスフェア培養法により増殖させた後、オンコジーンを導入後、大脳基底核に注入したところ、一ヶ月後には全例が脳腫瘍によって死亡した。この脳腫瘍は、多形性を示し、壊死巣とその周囲に堤防状に腫瘍細胞が配列するpseudopalisade、血管増殖、巨細胞などを認めた。部分的に、ニューロンマーカーTuJ1、グリアマーカーGFAPが陽性であり、多形性膠芽腫と判断された。一方、培養することも可能であり、limiting dilution により、single cell由来の培養ができること、single cell 由来であっても生体の中では、多様な腫瘍細胞が産み出され、originとなる腫瘍細胞とそこから“分化”した細胞によって、多形性膠芽腫が構成されていることが判明し、がん幹細胞特定のツールとなることが判明した。同様の方法によって、様々な組織において腫瘍モデルの作成、がん幹細胞の特定を進めることによって、がん幹細胞の共通性および組織特異性が理解できると期待される。さらに、この脳腫瘍を採取し、代謝産物を解析したところ、多くのアミノ酸が変動していることが明らかとなり、腫瘍の増殖・分化におけるアミノ酸代謝制御の役割が示唆された（合田グループとの共同研究）。今後、がん幹細胞から分化細胞の過程において、どのような代謝産物が変化しているのか、あるいは未分化な集団がいかなる代謝制御によって保たれているのかを解析することによって、がん治療の標的を特定したい。

■須田グループ

　昨年度までの我々の検討により、造血幹細胞システムの維持に低酸素環境の関与が強く示唆された。そこで、我々は超長期BrdU標識法とwhole mount骨髄免疫染色法を開発し、直接的に低酸素環境の造血幹細胞維持への関与を検討した。通常の長期BrdU標識法は、2ヶ月間〜6ヶ月間のBrdU wash outを行うが、より分裂の遅い造血幹細胞分画を検討するためにBrdU wash outを10ヶ月以上行う方法が我々の開発した超長期BrdU標識法である。また、whole mount骨髄免疫染色法とは、骨髄をそのまま固定し、免疫染色して顕微鏡観察する方法である。本法により、これまで切片で2次元的にしか検討されてこなかった骨髄の造血幹細胞ニッチを3次元的に検討できる。これら2つの新規手法を組み合わせて我々は、超長期BrdU保持細胞が低酸素マーカーPimonidazole陽性であることを見出した(論文5)。また、白血病細胞においてもその局在を明らかにした（論文6）。低酸素は、低活性酸素レベルの制御にも関与するが、この制御が造血幹細胞のみならず軟骨においても重要な役割があることを明らかにした（論文7,8）。骨髄抑制ストレスである5-FUを投与による造血亢進によってこうした超長期BrdU保持細胞は増殖期の造血幹細胞が発現するcyclin D1陽性となり、機能的に造血に貢献している可能性が示唆された。そこでin vivoにおけるこれらPimonidazole陽性の超長期非分裂細胞の維持を検討するために、現在低酸素応答の中心的遺伝子であるHIF-1遺伝子欠損マウスの検討を進めており、既にいくつかの細胞周期関連遺伝子や代謝関連遺伝子の発現異常と代謝経路の機能異常を造血幹細胞レベルで見出している。

■合田グループ

　幹細胞において特異的に発現調節されている遺伝子が“幹細胞らしさ”を維持する代謝経路の調節に関与している可能性を検討するために、Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry (CE-MS)を用いた全代謝解析を行った。本年度は、まず幹細胞維持に重要な転写因子であるFOXO3aにより誘導される代謝変動について解析を行った。その結果、FOXO3a発現誘導により解糖系およびTCA回路における代謝産物の増加、NADPHの低下を伴ったペントースリン酸回路(PMP)の代謝産物の減少が認められた。これらの結果より、FOXO3aはグルコース代謝経路、特にPMP代謝経路を抑制的に調節することで核酸代謝つまり増殖を抑制し、一方でエネルギー代謝を維持することで、結果的には幹細胞の未分化性維持を代謝の面で制御しているのではないかと考えられた。今後遺伝子発現プロファイルの結果と照らし合わせ、幹細胞の未分化維持に係わる代謝関連酵素の機能解析を進める必要があると考えられる。細胞培養レベルではなくin situでの代謝解析を行うために、マウス神経幹細胞を用いた脳腫瘍モデルにおいて、同一個体において腫瘍部と健常部の脳組織における代謝産物を測定してみた。健常部と比較して腫瘍部では乳酸値の軽度の上昇が認められるものの、はっきりとした解糖系の亢進は代謝変動からは言えなかった。しかし、PMP経路の代謝産物とデオキシ核酸は明らかに増加しており、腫瘍部における細胞増殖の亢進と一致しているように見えた。しかし、最も変動した代謝産物はアミノ酸であった。核酸代謝に係わるグルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸は減少したが、その他の多くのアミノ酸は増加する傾向が認められた。これは、腫瘍部における細胞が積極的にアミノ酸輸送体を介して細胞増殖に必要なエネルギーやタンパク質合成を維持するために認められた現象でないかと考えられる。一方、幹細胞に発現亢進が認められるBrcp-1遺伝子を導入した細胞群におけるC13-glucose負荷による細胞内代謝産物の経時的な変化を解析した。その結果、遺伝子導入群ではピルビン酸から乳酸への変換が抑制されている可能性を示す結果が得られた。また、この細胞群はほぼ全てのアミノ酸含量が低下していることがわかっており、増殖サイクルに入った腫瘍部の代謝変動と全く逆パターンであることが示された。以上の結果より、アミノ酸代謝調節が幹細胞機能維持に何らかの役割を演じているのではないかと考え、今後更に幹細胞固有の代謝制御の全貌解明に取り組む予定である。

■田賀グループ

1)血液系：胎生期のマウス造血組織を対象に研究しているが、これは胎生期の造血組織がマウスの個体発生の進行に伴って、例えば大動脈-生殖原基-中腎(AGM)領域、肝臓、胎盤と、その存在が変遷することから、時期と場所に特異的な幹細胞特性の変化と幹細胞ニッチの変化に取り組む好材料であり、未解明の癌幹細胞の特性と癌幹細胞ニッチの理解に結びつく可能性があるためである。前年度までに、マウスAGM領域のin vitroにおける分散培養の解析からCD45lowc-Kit+細胞集団に各種血液細胞に分化する能力があることを明らかにした。本年度は、このin vitroの結果を踏まえて、in vivoの状況を考察した。胎生10.5日胚のAGM領域の細胞を培養せずにCD45とc-Kitの発現強度に基づき分取し、ストローマ細胞との共培養で生じる血球細胞コロニー数の検討を行った結果、in vitroの観察と同様な造血能を有する集団（CD45lowc-Kit+）の存在が明らかになった。造血幹細胞の１つの性質であるside population(SP)の有無をHoechst33342染色で解析したところ、CD45lowc-Kit+細胞集団にSP細胞を認めた。CD45lowc-Kit+集団中のSP細胞およびmain population細胞を比較すると、前者に高いmixコロニー形成能を認めた。この結果はin vivoでAGM領域にはCD45lowc-Kit+のSP細胞分画に高い造血活性を有する細胞が存在することを示唆する。別途進行中の胎盤ニッチ細胞の樹立研究と今後平行して研究することで、幹細胞特性の変化と幹細胞ニッチの変化の理解に努める。

2)神経系：幹細胞の自己複製つまり分化誘導シグナルと拮抗しながら未分化性を維持しつつ増殖を続ける過程の理解は、癌幹細胞の制御に重要な示唆を与えるものである。幹細胞の自己複製機構を解明する上で重要な、幹細胞分化制御シグナルの標的遺伝子の同定と解析を実施した。神経幹細胞にアストロサイト分化誘導性のサイトカインLIFとBMP2を添加し、発現が誘導される標的遺伝子として同定したもののうち、SOCS3については昨年度報告したので詳細は省略するが、LIF刺激により神経幹細胞内で活性化された転写因子STAT3が核に移行し、BMP2の遺伝子プロモーター上に結合してBMP2遺伝子の発現を誘導し、それが神経幹細胞を刺激すること転写因子Smad1のリン酸化を経た核移行を促し、STAT3-Smad1-p300複合体が形成され効率よくアストロサイト分化に至ることが示された。この成果はサイトカインネットワークによる神経幹細胞制御機構に新たな示唆を与えるものであり今年度論文発表した(論文11,12)。このプロジェクトでSOCS3以外に同定した遺伝子に、CBP/p300-Interacting Transactivator with Glu/Asp-rich C-terminal Domain 1 (CITED1)がある。癌細胞における転写共役因子CITED1の発現亢進や細胞内局在の変化が報告されていることから、幹細胞の未分化性を維持した増殖における意義を明らかにする予定である。

■岩間グループ

　昨年度からの継続研究として、マウス胎仔肝幹/前駆細胞にポリコーム遺伝子Bmi1あるいは活性化型b�-cateninを強制発現させる実験を行い、肝幹/前駆細胞が二分化能を維持したまま形質転換し、NOD/SCIDマウスの皮下、肝臓に腫瘍を形成することを確認した。この結果より、肝幹/前駆細胞の過剰な自己複製が肝発癌における初期イベントとなる可能性について報告した(論文13)。また、この腫瘍化の過程において、Bmi1の重要な標的遺伝子であり細胞老化制御に密接に関連するCdkn2a(Ink4a/Arf)遺伝子の意義を検証するため、Ink4a-Arf-/-マウスから胎仔肝幹/前駆細胞を分離し同様の実験を行った。Ink4a-Arf-/-胎仔肝幹/前駆細胞はin vitroでの形質転換は示したものの、NOD/SCIDマウスに移植しても腫瘍を形成しないことが示され、Bmi1の強制発現による腫瘍形成の過程においては、Ink4a-Arf遺伝子以外にもBmi1の重要な標的遺伝子が存在し、その発現抑制が腫瘍化には必須であるものと考えられ、その同定を進めている。同様の所見はマウス白血病モデルにおいても確認され、Bmi1は白血病幹細胞において、Ink4a-Arf遺伝子とともに、未同定の標的遺伝子を抑制することにより白血病幹細胞の自己複製能を維持するものと考えられ、同様に、標的遺伝子の同定を進めている。ヒト肝がんサンプルにおけるがん幹細胞の同定は、いまだ試行錯誤の途中であり、アプローチの改善に努めているところである。また、分担研究者の須田との共同研究において、癌抑制遺伝子Fbxw7の機能解析を行い、Fbxw7が造血幹細胞においてc-Myc、やNotchの蛋白分解を制御することにより造血幹細胞の維持に必須な機能を有すること、また、その機能破綻が白血病幹細胞の出現に直結することを明らかにした(論文10)。さらに、造血幹細胞・白血病幹細胞における自己複製分子の機能解析を行い、Notchシグナル分子Mam-1(論文14)やオステオポンチン(論文15)の機能、ヒストンメチル化酵素MLLの白血病における新規融合遺伝子(論文16)の同定や、造血幹細胞ニッチ細胞から分泌されるTGF-bの造血幹細胞の細胞周期制御における意義について成果を得た。

§3．研究実施体制

(1)平尾グループ

　　�@　研究分担グループ長：　平尾　敦（金沢大学、教授）
　　�A　研究項目
　　　　　・ 正常組織幹細胞とがん幹細胞の代謝解析

(2)須田グループ

　　�@　研究分担グループ長：　須田　年生（慶應義塾大学、教授）
　　�A　研究項目
　　　　　・ 造血幹細胞の代謝解析

(3)合田グループ

　　�@研究分担グループ長：　合田　亘人（早稲田大学、教授）
　　�A　研究項目
　　　　　・ 各種幹細胞の代謝産物の測定

(4) 田賀グループ

　　�@　研究分担グループ長：　田賀　哲也（熊本大学、教授）
　　�A　研究項目
　　　　　・ 組織幹細胞および脳腫瘍におけるがん幹細胞の代謝解析

(5)岩間グループ

　　�@　研究分担グループ長：　岩間　厚志（千葉大学、教授）
　　�A　研究項目
　　　　　・ 造血幹細胞および肝がんにおけるがん幹細胞の代謝解析

§4．成果発表等

(1) 原著論文発表

　　�@　発表総数（国内　0件、国際　15件）
　　�A　論文詳細情報