体節形成には適切なシグナル伝達の遅れが大切

脊椎動物では、受精卵から体が形づくられる発生の一時期に、背骨・肋骨などの「節目」構造の元となる、体節と呼ばれる組織が形成されます。体節は胚の後方にある未分節中胚葉（Ｐｒｅｓｏｍｉｔｉｃ ｍｅｓｏｄｅｒｍ：ＰＳＭ）より、一定の周期で生み出されます。体節の形成周期は動物種によりさまざまで、マウスでは２～３時間、ヒトの場合は約５時間となります。この体節の形成周期は、Ｈｅｓ７遺伝子の周期的な発現量の振動（オシレーション）により生じます。ＰＳＭにおいて、個々の細胞のＨｅｓ７遺伝子発現量の振動は細胞間で同期し、組織レベルでの協調したリズムを生み出します。この振動により誘導される種々の遺伝子の働きにより、ＰＳＭの頭側部分が周期的にくびれ切れ、体節が形成されるのです。この細胞間の振動位相の調節の結果、同期が生じ、それが、秩序だった体節構造の形成に重要であると考えられています。この細胞どうしの同期が乱れると、体節の癒合や形態形成異常を引き起こします。このように、ＰＳＭにおけるＨｅｓ７遺伝子発現量の振動の同期は正常な体節形成において非常に重要な要因です。しかしながら、個々の細胞の振る舞いを観察することが困難なため、その分子メカニズムの詳細は明らかにされていませんでした。

これまで、Ｎｏｔｃｈシグナル経路がこの調節に重要であることがさまざまな生物種で報告されており、マウスでは、Ｎｏｔｃｈシグナルの調節に関わる糖転移酵素Ｌｕｎａｔｉｃ ｆｒｉｎｇｅ（Ｌｆｎｇ）遺伝子の発現量がＨｅｓ７の下流で振動し、同期の調節を仲介していることが示唆されてきました。実際に、Ｌｆｎｇ遺伝子を欠損したマウスでは、体節形成の周期性が乱れ、細胞間でＨｅｓ７遺伝子の発現量が同期せずにばらつきがみられます。しかし、従来の解析は固定組織の観察に基づいており、個々の細胞における実際のＨｅｓ７の動態は分かっていませんでした。Ｌｆｎｇ遺伝子が同期メカニズムに果たす役割を明らかにするためには、個々の細胞におけるＨｅｓ７遺伝子発現量の振動の位相を可視化し、定量する必要がありましたが、マウス胚においてそれを可能にする実験系は確立されていませんでした。

（１）１細胞レベルでＨｅｓ７遺伝子発現を計測できるライブイメージング系の構築

本研究では、ＰＳＭの個々の細胞におけるＨｅｓ７遺伝子発現量の振動位相を定量的に測定するために、Ｈｅｓ７遺伝子発現により蛍光を発するレポーターマウスの樹立と、ライブイメージングによる観察系を確立しました。半減期が約２０分程度と非常に短命なＨｅｓ７タンパク質の動態を追うためには、細胞内での蛍光タンパク質が持つ蛍光団の成熟に要する時間の短縮が鍵となります。そこで、既存の黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを改良し、成熟速度を速めた新規の黄色蛍光タンパク質Ａｃｈｉｌｌｅｓを開発しました。本研究ではＰＳＭにおいてこのＡｃｈｉｌｌｅｓとＨｅｓ７の融合タンパク質を発現することのできるレポーターマウスを樹立し、ライブイメージングを行うことで、１細胞レベルでＨｅｓ７遺伝子の発現を定量できることを示しました。

（２）Ｌｆｎｇ遺伝子が細胞どうしの同期調整に影響を与える

この系を用いて、野生型とＬｆｎｇ遺伝子が働かない変異型のＰＳＭにおけるＨｅｓ７遺伝子の動態を１細胞レベルで定量・比較しました。その結果、Ｌｆｎｇ変異型ＰＳＭでは、個々の細胞におけるＨｅｓ７の振動の振幅が弱まり、その周期が短くなること、また、振動位相の同期率が低くなることが明らかになりました。また、これらの細胞をばらばらにして分散培養することで、結果的にＮｏｔｃｈシグナル経路を介した細胞間の同期調整のない状態で観察すると、同期はしないものの、振動周期や振幅の大きさにほとんど差がなかったことから、Ｌｆｎｇは主に細胞間の同期調整に影響を与えていると考えられます。

（３）Ｌｆｎｇ遺伝子が隣接する細胞へのシグナル伝達時間を少し遅らせる働きをもつ

次に、Ｌｆｎｇ遺伝子が細胞間の振動同期の調整に与える影響について明らかにするために、野生型とＬｆｎｇ遺伝子変異型のＰＳＭ細胞を混合培養した際の振動を調べました。細胞数比１：２０の割合で野生型とＬｆｎｇ変異型の細胞を混ぜると、野生型の細胞は、約１／８周期進んだ位相ピークを示したことから、シグナルを送る細胞でＬｆｎｇが失われると、受信側の位相を早めることが分かりました。また逆に、細胞数比２０：１の割合で野生型とＬｆｎｇ変異型の細胞を混ぜると、変異型の細胞は野生型の細胞の振動位相に効率よく同期できなかったことから、Ｌｆｎｇはシグナルを受信する細胞でＨｅｓ７遺伝子の振幅を調節することが示唆されました。さらに、近年確立したオプトジェネティクス^注）によるＮｏｔｃｈシグナル送信／受信細胞の計測系を用いた解析により、培養細胞において、Ｌｆｎｇ遺伝子がシグナル送信細胞に発現していると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に要する時間が長くなることが明らかになりました。これは、Ｌｆｎｇ遺伝子を発現する送信細胞で、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関わるＤｌｌ１タンパク質の膜への輸送が遅れることに起因することが示唆されました。一方、Ｌｆｎｇ遺伝子がシグナル受信細胞に発現していると、受信細胞での応答の振幅が大きくなることが分かりました。また、数理モデルによるシミュレーションから、適切な時間遅れが振動の同期に非常に重要であり、時間遅れを長く、あるいは短くすると、振動は減弱し、同期が低下することが示唆されました。このことから、ＬｆｎｇはＮｏｔｃｈシグナル伝達の時間遅れを生じさせることにより、Ｈｅｓ７遺伝子による同期を調節していることが考えられました。

（４）シグナル伝達時間の遅れがもつ重要性について

最後に、同期の調節におけるシグナル伝達の時間遅れの重要性についてさらに検討するために、Ｌｆｎｇ変異型遺伝子発現細胞において低分子化合物を加え、時間遅れを長くする効果のある化合物を探すレスキュー実験を試みました。ＥＳ細胞由来のＰＳＭ様組織を用いた薬剤スクリーニングでは、時間遅れに影響を与える複数の低分子化合物を見いだしました。その中で、Ｗｎｔシグナル阻害剤として知られるＫＹ０２１１１が時間遅れを長くする効果を示し、Ｌｆｎｇ変異型遺伝子発現細胞におけるＨｅｓ７遺伝子の振動の振幅の大きさと同期率を部分的に回復させました。

以上の結果から、Ｌｆｎｇ遺伝子がＰＳＭにおいて細胞間のＮｏｔｃｈシグナル経路を介し、伝達の時間遅れを延ばすことにより、振動の同期を調節していることが明らかになりました。

本研究は、細胞間のシグナル伝達の時間の調節が集団レベルのダイナミクスに及ぼす影響について明らかにしました。Ｌｆｎｇ遺伝子はヒトにおける先天性側弯症の原因遺伝子として知られており、本成果は、病態の発生メカニズムの解明につながると考えられます。また、自然界に普遍的にみられるその他のリズム現象の同期メカニズムへの理解につながると期待されます。