カルシウム振動が生み出されるメカニズムを説明する新たな知見

１．背　景

　カルシウムは、私たちの骨格を構成する主要元素であるとともに、細胞内において情報を伝達する物質として重要な働きをしています。細胞内には極微量のカルシウムイオン（Ca²⁺）しかなく、Ca²⁺の濃度は通常、細胞外の10,000分の１程度に保たれています。しかしながら、細胞外から刺激が加わると、細胞中にある小胞体^※３に蓄積されていたCa²⁺が放出され、細胞内のCa²⁺濃度は1,000～10,000倍にも増加します。
　細胞外から刺激を受け取った細胞を詳しく観察すると、刺激に伴い細胞内のCa²⁺濃度が　　急激に上昇した後、緩やかに元のCa²⁺濃度に戻るスパイク状の時間変化（カルシウムスパイク）を引き起こします。また多くの細胞では、このCa²⁺濃度の変化が周期的に繰り返し引き起こす現象が見られます。これらの現象は、カルシウム振動と呼ばれ、生命現象の始まりである受精を引き起こすとともに、ホルモンや消化酵素の放出や、免疫、遺伝子発現など広範な生理機能に関わっていると考えられます。
　細胞外からの刺激物質の濃度は、ゆっくりと連続的に変化します。それに対して、刺激に反応して起こる細胞内のカルシウム振動は、急激なCa²⁺濃度の上昇と下降が非連続的に繰り返すことで発生します。また、その結果もたらされる生理現象は、このカルシウム振動の周期によって制御されています。このことから細胞は、刺激物質の濃度というアナログ値をカルシウム振動の周期というデジタル値に変換し、細胞外刺激によりもたらされた情報を細胞内に伝えていると考えられています。
　細胞外からの刺激に関する情報は、刺激物質が細胞膜上の受容体（レセプター）に結合することで細胞内に伝えられます。刺激を受け取った細胞は、イノシトール三リン酸（IP₃）を産生します。このIP₃が小胞体の表面に存在し、Ca²⁺の放出を調整するカルシウムチャネル（IP₃受容体）に作用（結合）することにより、細胞内のCa²⁺濃度の上昇を引き起こします。刺激を受けた細胞の細胞内カルシウム濃度は、まずゆっくりと上昇し、ある一定の濃度を越えると急激に上昇します。この急激なCa²⁺濃度の変化は、一旦始まると上昇する速度と到達する最大カルシウム濃度が、細胞外刺激の濃度に依らずほぼ一定となります。これら一連の変化を起こすためには、Ca²⁺濃度の上昇を引き起こす機構に正のフィードバック^※４がかかっていることが示唆されてきました。
　この正のフィードバック機構を説明するために、二つの仮説が立てられています（図１）。一つは「IP₃産生の段階での正のフィードバック機構を考えるモデル（仮説１）」、もう一つは「カルシウム放出の段階で正のフィードバック機構を考えるモデル（仮説２）」です。この２つの仮説に基づき、コンピューターシミュレーションを用いて、カルシウム振動を再現することが試みられています（図２）。仮説１のモデルは、1988年にMeyer T.とStryer L.の研究グループによって、周期的なIP₃スパイクによって、カルシウム振動を作り出されるとされました。それに対して仮説２のモデルでは、1992年にDe Young GWとKeizer J.の研究グループによって、周期的なIP₃のスパイクがなくともIP₃受容体がカルシウム振動を作り出すことができるというものです。
　これら二つの仮説のいずれが正しいのかを、実験的に確認するためにはIP₃濃度変化を定量的に測定することが必要であり、IP₃可視化技術の開発が長い間待たれていました。

２．研究手法と成果

IP₃とカルシウム振動との関係を明らかにするためには、IP₃の挙動を正確に捉えることが必要です。研究グループでは、Ca²⁺の上流シグナルであるIP₃の挙動を可視化する、IP₃センサータンパク質を開発しました。これは研究グループの成果として2002年に得られたIP₃受容体の立体構造^※５をもとに、IP₃結合ドメインのアミノ末端（N末端）にECFP（青色蛍光タンパク質）とカルボキシ末端（C末端）にVenus（ヴィーナス：黄色蛍光タンパク質）を融合させたタンパク質で、IP₃と結合することでECFP - Venus間のFRET^※６（蛍光エネルギー移動）効率が変化し、蛍光特性が変わることを利用したものです。研究グループでは、この融合タンパク質をIRIS（IP₃ Receptor-based IP₃ Sensor）と命名しました（図３）。
さらに研究グループでは、IP₃結合ドメインのC末端を短くすることで検出感度を５％から２５％と５倍に増大させることに成功しました。またIRISの開発にあたり、細胞内のIP₃動態の撹乱を最小限にとどめることに最も注意を払いました。結合活性が強すぎると、IP₃の分解を妨げるなどして、本来のIP₃の濃度変化、さらにはCa²⁺の濃度変化を変えてしまう恐れがあります。そのためIRISはIP₃に対する特異性を下げずに、結合活性を元よりも１０倍程度弱くなるように改変されています。
このIRISとカルシウム指示薬を細胞に導入することによって、細胞内のIP₃とCa²⁺の挙動を同時に可視化するとともに、これまで測定が難しかったIP₃の濃度変化を定量的に捉えることに成功しました。またIRISの導入によって、Ca²⁺の挙動にほとんど影響がないことも確認しました。

仮説１のモデルのようにカルシウムスパイクがIP₃産生の段階で正のフィードバック調節によって制御されるならば、IP₃濃度とCa²⁺濃度の時間変動が同じであることが予想されます。一方、仮説２のモデルでは、IP₃スパイクがなくともカルシウムスパイクが起こることが示唆されます。
研究グループは、新たに開発したIRISを用いて細胞内のIP₃とCa²⁺の濃度変化の挙動を正確に観察しました。その結果、細胞内のIP₃濃度が、Ca²⁺の濃度が上昇し始める前から一定速度で高まり、Ca²⁺濃度が急速に上昇する際でもその速度は変化しないことを明らかにしました（図４）。このことから「カルシウム依存的なIP₃産生は、カルシウムスパイクを引き起こす正のフィードバック機構ではない」こと、つまり仮説１を否定し、受容体からCa²⁺が放出される段階での正のフィードバック機構により、カルシウムスパイクが生み出されているというモデル（仮説２）を支持する知見を得たことになります。
次に研究グループは、カルシウム振動時のIP₃の挙動を観察しました。すると予測されたように、カルシウムのような大きなIP₃の濃度変化は観測されず、カルシウム振動生成にはIP₃スパイクが必要ないことが明らかになりました。
さらに研究グループは、繰り返し起こるカルシウムスパイクに伴い、細胞内にIP₃が徐々に蓄積されていくことを発見しました。この結果は、周期的に起こるカルシウムのスパイクは、それぞれ異なるIP₃濃度で引き起こされることを示し、「カルシウムスパイク誘導におけるIP₃の閾（いき）値は一定ではない」ことを示唆します（図５）。
このようにスパイク状に急峻な濃度変化を起こすカルシウムに比べ、IP₃が比較的ゆっくりと濃度変化することから、その下流で働くIP₃受容体によってアナログ的なIP₃シグナルがカルシウムスパイクというパルスシグナルに変換されていることが示されました。またその変換の過程ではIP₃の閾値は一定ではなく、IP₃受容体が細胞内情報伝達系による情報符号化の際に複雑な情報変換を行い、そして極めて重要な役割を担っていることがわかりました（図６）。

３．今後の期待

　今回、細胞内のIP₃の濃度変化を定量的に観察する技術を新たに開発したことにより、IP₃受容体が細胞内情報伝達系による情報符号化の際に複雑な情報変換を行い、そして極めて重要な役割を担っていることがわかりました。カルシウム振動は生体機能をつかさどる重要なシステムであり、今回得られた知見は、カルシウム振動の生成メカニズムに一石を投じる成果です。
　今後、IP₃の濃度とカルシウム振動の周期の関係を詳細に調べることで、IP₃受容体がどのようにIP₃シグナルをカルシウムシグナルに変換するのか、つまり細胞がカルシウムを用いて情報を符号化するメカニズムを明らかにすることが期待できます。