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平成25年5月21日

東京大学
北海道大学
科学技術振興機構

人工的に作り出したホタルの光の明滅を使って
生体内のpH変化をモニターする技術の開発

ポイント

<発表概要>

東京大学 大学院理学系研究科の服部 満 特任研究員と小澤 岳昌 教授らは、北海道大学 大学院保健科学研究院の尾崎 倫孝 教授らとの共同研究により、動物体内のpH環境変化を、人工的に作り出したホタルの光の明滅の変化として捉え、長時間モニターする方法を開発しました。

正常な細胞は、各種酵素が適切に働くことで、細胞内のpHがおよそ7.2〜7.4に保たれています。しかし、細胞がガン化や低酸素状態になると、細胞内のpHが低下する(酸性化)ことが知られています。このような細胞内のpH環境をモニターする研究は、培養細胞を用いて盛んに進められてきましたが、マウスのような生きた動物個体内のpH環境を長時間安定して観測することは容易ではありませんでした。

ホタルの光の強度や色の違いを用いたさまざまな分析法はこれまでも開発されてきました。今回本研究開発チームは、ホタルのもう1つの特徴である光の明滅現象に着目しました。特殊なホタルの光源であるルシフェラーゼ注1)という酵素を改変して、人工的に明滅できるシステムを開発しました。そして、この明滅の速度がpHに感受性があることから、安定して動物個体内のpH環境を観測する方法を確立しました。

生きた体内でのpH環境をモニターすることができる本システムは、pH変化を通して生体内の異常を簡便に検査する技術に繋がると期待されます。

<研究の背景・先行研究における問題点>

細胞の中にあるタンパク質は、その周囲の環境によってはたらきが大きく変化します。このような環境条件の重要なポイントの1つにpHが挙げられます。細胞はタンパク質が効率よく働けるようにpHを自らコントロールし、内部のpHをおよそ7.2に保っています。また、不必要になったタンパク質を分解するための、pHが低い(酸性)場所も区分けして持っています。ところで細胞は、異常な環境におかれることで正常なpH値を保てなくなることが知られています。例えば、酸素が欠乏している状態ではpHが減少(酸性化)しますし、ウイルスなどに感染した場合でもpHは大きく乱れます。また、ガン化した細胞には不要なタンパク質が蓄積していますが、これはpHによるタンパク質のコントロールに異常を来していることが理由の1つと考えられます。したがって、細胞のpHをモニターすることは、細胞のコンディションを判断するのに有効であり、pHはさまざまな疾患や障害において、異常な細胞を見分けるための共通したマーカーとなります。そのため、個々の細胞でのpH変化のみならず、もっと大きな細胞集団、例えば身体の組織、臓器、または炎症部位や腫瘍などのpHを測る技術が求められています。

細胞の中のpHを測定するためには、細胞を壊さずに生きたまま測る必要があります。古くから用いられている方法では、蛍光性のある標識物質(蛍光プローブ)を細胞の中に浸透させた状態で外から光を当てて、放出された蛍光の波長からpHを計算していました。しかしながらこの方法を生きた動物個体に用いると、細胞自身が光ってしまうため正確な値を測るのは困難です。また、長時間光を当て続けるのは細胞にとって大きなダメージとなります。したがって、生きた動物個体で、長時間安定してpHをモニターする技術の開発が急務でした。

<研究内容>

本研究開発チームはまず、従来の蛍光性のプローブではなく、生物発光を利用したプローブの開発に新しく取りかかりました。生物発光はホタルの光に代表されるとおり、外から光を当てなくても自ら光る化学反応です。新しく開発した発光プローブには、ホタルの光を生み出す元となっている発光タンパク質「ルシフェラーゼ」とともに、イネ科の植物が持っている「LOV2注2)」というタンパク質を使いました。このLOV2は、青い光を当てるとその構造が変化し、さらに光を止めると元の構造に戻る性質があります。ルシフェラーゼを2つに分割して、それぞれをLOV2の両端に繋げました。この融合タンパク質は、通常通りルシフェラーゼの発光を観察できますが、青い光を当てると一時的に発光が弱まり、しばらくするとまた元の強さに回復しました(図1)。そこで、この新しい発光プローブをPI−Luc(hoto−nactivatable Luciferase)と命名しました。PI−Lucの発光は照射する光によって自在にコントロールすることができるため、PI−Lucを持った細胞集団を使って文字を書くこともできます。

このPI−Lucに青色光を当てた後の発光の回復時間を計測すると、酸性であるほど回復が遅くなることを発見しました(図2)。つまり、発光の回復時間を測ることで周囲のpHをモニターすることができます。PI−Lucを実際に生きたマウス足先の皮下に導入して外から光を照射すると、やはり発光が一時的に減少し次第に回復しました(図3)。この回復する速度を画像に変換することで、生きたマウス体内でのpH環境をイメージングすることに成功しました。このイメージング技術を用いることで、血管を止めて酸欠状態にしたマウスの足先でのpHの低下を時間経過とともに捉えることに成功しました。

<社会的意義・今後の予定など>

本研究開発では、生きた動物個体内でのpH環境を長時間安定してモニターすることを実現しました。多くの炎症や悪性腫瘍はそのマーカーとなる物質が発見・開発されておらず、PI−Lucを用いたpHの測定法は、生体内の異常を簡便に検査する技術に繋がると期待されます。また、手術時の止血処置などで臓器が酸化ストレスを受けると障害を引き起こす場合があり、そのようなストレスからなる臓器障害のメカニズムを解析するツールとしての利用が予想されます。

本研究開発は、JST 先端計測分析技術・機器開発プログラム(要素技術タイプ)、科学研究費補助金 若手研究(S)、私立大学 戦略的研究基盤形成支援事業、三菱財団 自然科学研究助成、日本科学協会 笹川科学研究助成に支援をいただきました。

<参考図>

図の詳細については、下記URLよりご覧いただけます。
http://www.s.u-tokyo.ac.jp/b/ozawa20130521

図1

図1 開発した発光プローブ「PI−Luc」

発光タンパク質ルシフェラーゼを2つの断片に分割して、それぞれLOV2タンパク質の端に繋げた。暗所ではルシフェラーゼ断片が互いに接近して結合するため発光する。青色光を当てるとLOV2に構造変化が生じ、ルシフェラーゼ断片間の距離が広くなるため消光する。グラフは、PI−Lucを導入した細胞に青色光を定期的に当てた場合の発光値の変化。照射後に発光量は一時的に減少するが、数分で元の値に回復した。下の画像では、PI−Lucを導入した細胞集団に文字型を通して光を照射して、「PI−LUC」の形にそれぞれ消光した。白棒は1mmを示す。

図2

図2 PI−Lucの発光回復時間とpHとの関係

左のグラフは、それぞれのpH下でPI−Lucに青色光を当てたときの発光値の回復曲線を示す。pHによって回復の時間が異なる。右のグラフは、pH値ごとの発光の回復時間を計算してグラフ上にプロットした。pHが低いほど(酸性)回復時間が長くなる。下の画像は、PI−Lucを持つ細胞集団に青色光を当てた後、写真の画素(ピクセル)ごとに発光の回復時間を計算して色変換したもの。結果、細胞内のpHをイメージングすることに成功した。

図3

図3 生きた動物個体内でのpH変化イメージング

上の連続画像は、PI−Lucを導入したマウスの足先を撮影した発光画像。青色光を照射した後、20秒間ずつカメラを露光して発光を撮影した。発光が一度弱まった後再び回復した。白棒は10mmを示す。下の画像は、発光回復時間を利用したマウス足先のpH変化イメージング。止血処理を行い、その際のpH変化をPI−Lucの発光回復時間イメージングを利用してモニターした(下段)。止血時に酸性領域が増加していることが確認された。白棒は10mmを示す。

<用語解説>

注1) ルシフェラーゼ
ホタルなどの発光生物において、発光を伴う化学反応を触媒するタンパク質酵素。生物内に存在する発光化学物質と反応することで、発光が生じる。基礎研究においては、調べたい遺伝子の中にルシフェラーゼ遺伝子を組み込むことで、その遺伝子からどれくらいタンパク質が作られているかを発光の強さから調べることができる。
注2) LOV2
植物が持つ光受容体タンパク質フォトトロピンの一部分の名称。青色の光を吸収することで構造が変化する。この構造変化によって、植物が光の方向へ曲がる現象や、葉の気孔の開閉などが引き起こされる。

<発表雑誌>

雑誌名:「Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America」
論文タイトル:Sustained Accurate Recording of Intracellular Acidification in Living Tissues with a Photo-controllable Bioluminescent Protein
著者:Mitsuru Hattori, Sanae Haga, Hideo Takakura, Michitaka Ozaki and Takeaki Ozawa
doi: 10.1073/pnas.1304056110

<お問い合わせ先>

<研究に関すること>

小澤 岳昌 (オザワ タケアキ)
東京大学 大学院理学系研究科 化学専攻 教授
〒113-8654 東京都文京区本郷7−3−1
Tel:03-5841-4351 Fax:03-5802-2989
E-mail:

尾崎 倫孝(オザキ ミチタカ)
北海道大学 北海道大学院保健科学研究院 教授
〒062-0812 札幌市北区北12条西5丁目
Tel:011-706-4753/3337 Fax:011-706-4753
E-mail:

<取材に関すること>

東京大学 大学院理学系研究科 理学部
広報室 副室長(准教授) 横山 広美/特任専門職員 武田 加奈子
Tel:03-5841-8856
E-mail:

北海道大学 総務企画部 広報課
〒060-0808 北海道札幌市北区北8条西5丁目
Tel:011-706-2610 Fax:011-706-4870
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ホームページURL:http://www.hokudai.ac.jp

<JSTの事業に関すること>

久保 亮(クボ アキラ)、菅原 理絵(スガワラ マサエ)
科学技術振興機構 産学基礎基盤推進部 先端計測室
〒102-0076 東京都千代田区五番町7 K’s五番町
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