人工的に作り出したホタルの光の明滅を使って
生体内のｐＨ変化をモニターする技術の開発

ポイント

• ホタルの光の明滅を人工的に作り出し、その明滅の速度を計ることで、生きた動物内でのｐＨ変化を長時間安定してモニターする方法を開発しました。
• これまで生きた動物体内でのｐＨ環境を測定することは容易ではありませんでした。今回開発した技術により、動物体内のｐＨ変化を数時間安定してイメージングする方法を確立しました。
• 細胞がガン化、もしくは低酸素状態になると、細胞内のｐＨが低下（酸性化）することが知られています。ｐＨのモニタリングを通して、生体内の異常を簡便に検査する技術に繋がると期待されます。

＜発表概要＞

東京大学 大学院理学系研究科の服部 満　特任研究員と小澤 岳昌　教授らは、北海道大学 大学院保健科学研究院の尾崎 倫孝　教授らとの共同研究により、動物体内のｐＨ環境変化を、人工的に作り出したホタルの光の明滅の変化として捉え、長時間モニターする方法を開発しました。

正常な細胞は、各種酵素が適切に働くことで、細胞内のｐＨがおよそ７．２～７．４に保たれています。しかし、細胞がガン化や低酸素状態になると、細胞内のｐＨが低下する（酸性化）ことが知られています。このような細胞内のｐＨ環境をモニターする研究は、培養細胞を用いて盛んに進められてきましたが、マウスのような生きた動物個体内のｐＨ環境を長時間安定して観測することは容易ではありませんでした。

ホタルの光の強度や色の違いを用いたさまざまな分析法はこれまでも開発されてきました。今回本研究開発チームは、ホタルのもう１つの特徴である光の明滅現象に着目しました。特殊なホタルの光源であるルシフェラーゼ^注１）という酵素を改変して、人工的に明滅できるシステムを開発しました。そして、この明滅の速度がｐＨに感受性があることから、安定して動物個体内のｐＨ環境を観測する方法を確立しました。

生きた体内でのｐＨ環境をモニターすることができる本システムは、ｐＨ変化を通して生体内の異常を簡便に検査する技術に繋がると期待されます。

＜研究の背景・先行研究における問題点＞

細胞の中にあるタンパク質は、その周囲の環境によってはたらきが大きく変化します。このような環境条件の重要なポイントの１つにｐＨが挙げられます。細胞はタンパク質が効率よく働けるようにｐＨを自らコントロールし、内部のｐＨをおよそ７．２に保っています。また、不必要になったタンパク質を分解するための、ｐＨが低い（酸性）場所も区分けして持っています。ところで細胞は、異常な環境におかれることで正常なｐＨ値を保てなくなることが知られています。例えば、酸素が欠乏している状態ではｐＨが減少（酸性化）しますし、ウイルスなどに感染した場合でもｐＨは大きく乱れます。また、ガン化した細胞には不要なタンパク質が蓄積していますが、これはｐＨによるタンパク質のコントロールに異常を来していることが理由の１つと考えられます。したがって、細胞のｐＨをモニターすることは、細胞のコンディションを判断するのに有効であり、ｐＨはさまざまな疾患や障害において、異常な細胞を見分けるための共通したマーカーとなります。そのため、個々の細胞でのｐＨ変化のみならず、もっと大きな細胞集団、例えば身体の組織、臓器、または炎症部位や腫瘍などのｐＨを測る技術が求められています。

細胞の中のｐＨを測定するためには、細胞を壊さずに生きたまま測る必要があります。古くから用いられている方法では、蛍光性のある標識物質（蛍光プローブ）を細胞の中に浸透させた状態で外から光を当てて、放出された蛍光の波長からｐＨを計算していました。しかしながらこの方法を生きた動物個体に用いると、細胞自身が光ってしまうため正確な値を測るのは困難です。また、長時間光を当て続けるのは細胞にとって大きなダメージとなります。したがって、生きた動物個体で、長時間安定してｐＨをモニターする技術の開発が急務でした。

＜研究内容＞

本研究開発チームはまず、従来の蛍光性のプローブではなく、生物発光を利用したプローブの開発に新しく取りかかりました。生物発光はホタルの光に代表されるとおり、外から光を当てなくても自ら光る化学反応です。新しく開発した発光プローブには、ホタルの光を生み出す元となっている発光タンパク質「ルシフェラーゼ」とともに、イネ科の植物が持っている「ＬＯＶ２^注２）」というタンパク質を使いました。このＬＯＶ２は、青い光を当てるとその構造が変化し、さらに光を止めると元の構造に戻る性質があります。ルシフェラーゼを２つに分割して、それぞれをＬＯＶ２の両端に繋げました。この融合タンパク質は、通常通りルシフェラーゼの発光を観察できますが、青い光を当てると一時的に発光が弱まり、しばらくするとまた元の強さに回復しました（図１）。そこで、この新しい発光プローブをＰＩ－Ｌｕｃ（Ｐｈｏｔｏ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）と命名しました。ＰＩ－Ｌｕｃの発光は照射する光によって自在にコントロールすることができるため、ＰＩ－Ｌｕｃを持った細胞集団を使って文字を書くこともできます。

このＰＩ－Ｌｕｃに青色光を当てた後の発光の回復時間を計測すると、酸性であるほど回復が遅くなることを発見しました（図２）。つまり、発光の回復時間を測ることで周囲のｐＨをモニターすることができます。ＰＩ－Ｌｕｃを実際に生きたマウス足先の皮下に導入して外から光を照射すると、やはり発光が一時的に減少し次第に回復しました（図３）。この回復する速度を画像に変換することで、生きたマウス体内でのｐＨ環境をイメージングすることに成功しました。このイメージング技術を用いることで、血管を止めて酸欠状態にしたマウスの足先でのｐＨの低下を時間経過とともに捉えることに成功しました。

＜社会的意義・今後の予定など＞

本研究開発では、生きた動物個体内でのｐＨ環境を長時間安定してモニターすることを実現しました。多くの炎症や悪性腫瘍はそのマーカーとなる物質が発見・開発されておらず、ＰＩ－Ｌｕｃを用いたｐＨの測定法は、生体内の異常を簡便に検査する技術に繋がると期待されます。また、手術時の止血処置などで臓器が酸化ストレスを受けると障害を引き起こす場合があり、そのようなストレスからなる臓器障害のメカニズムを解析するツールとしての利用が予想されます。

本研究開発は、ＪＳＴ 先端計測分析技術・機器開発プログラム（要素技術タイプ）、科学研究費補助金 若手研究（Ｓ）、私立大学 戦略的研究基盤形成支援事業、三菱財団 自然科学研究助成、日本科学協会 笹川科学研究助成に支援をいただきました。

＜参考図＞

図の詳細については、下記ＵＲＬよりご覧いただけます。
http://www.s.u-tokyo.ac.jp/b/ozawa20130521

＜用語解説＞

注１） ルシフェラーゼ

ホタルなどの発光生物において、発光を伴う化学反応を触媒するタンパク質酵素。生物内に存在する発光化学物質と反応することで、発光が生じる。基礎研究においては、調べたい遺伝子の中にルシフェラーゼ遺伝子を組み込むことで、その遺伝子からどれくらいタンパク質が作られているかを発光の強さから調べることができる。

注２） ＬＯＶ２

植物が持つ光受容体タンパク質フォトトロピンの一部分の名称。青色の光を吸収することで構造が変化する。この構造変化によって、植物が光の方向へ曲がる現象や、葉の気孔の開閉などが引き起こされる。

＜発表雑誌＞

雑誌名：「Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America」
論文タイトル：Sustained Accurate Recording of Intracellular Acidification in Living Tissues with a Photo-controllable Bioluminescent Protein
著者：Mitsuru Hattori, Sanae Haga, Hideo Takakura, Michitaka Ozaki and Takeaki Ozawa
doi: 10.1073/pnas.1304056110

＜お問い合わせ先＞

＜研究に関すること＞

小澤 岳昌 (オザワ タケアキ)
東京大学 大学院理学系研究科 化学専攻　教授
〒113-8654 東京都文京区本郷７－３－１
Tel：03-5841-4351　Fax：03-5802-2989
E-mail：

尾崎 倫孝（オザキ ミチタカ）
北海道大学 北海道大学院保健科学研究院　教授
〒062-0812 札幌市北区北１２条西５丁目
Tel：011-706-4753/3337　Fax：011-706-4753
E-mail：

＜取材に関すること＞

東京大学 大学院理学系研究科 理学部
広報室　副室長（准教授）　横山 広美／特任専門職員　武田 加奈子
Tel：03-5841-8856
E-mail：

北海道大学 総務企画部 広報課
〒060-0808 北海道札幌市北区北８条西５丁目
Tel：011-706-2610　Fax：011-706-4870
E-mail：
ホームページＵＲＬ：http://www.hokudai.ac.jp

＜ＪＳＴの事業に関すること＞

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