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平成24年10月3日

科学技術振興機構(JST)
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東京大学 大学院工学系研究科
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人工カプセルでたんぱく質の生け捕りに成功

ポイント

JST 課題達成型基礎研究の一環として、東京大学 大学院工学系研究科 応用化学専攻の藤田 誠 教授、自然科学研究機構 岡崎統合バイオサイエンスセンターの加藤 晃一 教授らは、人工的に作り出した直径7ナノ(ナノは10億分の1)メートルのカプセル内部に、たんぱく質を丸ごと閉じ込めることに成功しました。

自然界では、たんぱく質やDNAなどの生体分子が、ウイルスの殻などの巨大なカプセル状の物質に閉じ込められて構造や活性が制御されたり、必要とされる時まで貯蔵されたりすることが知られています。人工的な化学現象でも、有機小分子などがホストと呼ばれる中空分子に閉じ込められて構造や活性が制御されることが知られています。しかし、これまで人工的に合成した精密な構造を持つ分子カプセルは大型化が難しく、たんぱく質のような大きな生体分子を閉じ込めることができませんでした。

今回研究チームは、金属イオンといくつかの工夫をした有機化合物を混ぜ合わせるだけで自然に秩序ある構造に組み上がる「自己組織化」を利用して金属錯体注1)(人工カプセル)を作製し、そのカプセルにたんぱく質を丸ごと閉じ込めることに成功しました。

この分子については、大型放射光施設SPring−8の構造生物学ビームライン(BL41XUとBL38B1)および高エネルギー加速器研究機構(KEK) フォトンファクトリーのPF−AR NE3Aビームラインで収集した結晶回折データを基に、理化学研究所 放射光科学総合研究センター 高田 昌樹 副センター長と高輝度光科学研究センター 熊坂 崇 副主席研究員のグループにより結晶中での分子構造が解析され、人工カプセルにたんぱく質が包み込まれた様子が明らかになりました。また、超遠心分析データを基に、大阪大学 工学研究科 生命先端工学専攻の内山 進 准教授のグループにより溶液中での分子量が解析され、溶液中でもカプセルがたんぱく質を安定に閉じ込めている様子が明らかになりました。

本手法により、巨大な生体分子を丸ごと精密な人工カプセルに包み込めることから、たんぱく質の構造決定や機能改変に応用することによって、創薬などの産業への貢献が期待されます。本研究成果は、2012年10月2日(英国時間)に英国科学雑誌「Nature Communications」のオンライン版で公開されます。

本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。

戦略的創造研究推進事業 チーム型研究(CREST)

研究領域 「ナノ界面技術の基盤構築」
(研究総括:新海 征治 崇城大学 教授/九州大学 工学部 ナノサイエンス学科 名誉教授)
研究課題名 「自己組織化有限ナノ界面の化学」
研究代表者 藤田 誠(東京大学 大学院工学系研究科 教授)
研究期間 平成19年10月〜平成25年3月

JSTはこの領域で、異種材料・異種物質状態間の接合界面を扱う研究分野の融合によってナノ界面機能に関する横断的な知識を獲得するとともに、これを基盤として界面ナノ構造を自在に制御し、飛躍的な高機能化を可能にする革新的なナノ界面技術を創出することを目的としています。上記研究課題では、独自技術を持って自己組織化構築される中空構造体の表面および内面で「有限系の界面化学」を展開し、新機能の創出や界面現象の解明を達成することを目標としています。

<研究の背景と経緯>

自然界ではたんぱく質やDNAなどの生体分子が、ウイルスの殻などの巨大なカプセル状物質に閉じ込められることで、構造や生理活性が制御されたり、必要とされる時まで貯蔵されたりすることが知られています。人工的な化学現象においても、中空のカプセル状分子(ホスト分子)が、ほかの分子(ゲスト分子)を内部に閉じ込める「ホスト−ゲスト」と呼ばれる化学現象がよく知られていて、ゲスト分子の構造や物性、反応性を制御できることが報告されています。例えば、リング状の分子構造を持つクラウンエーテルは、リングの大きさに適合する陽イオンを選択的にリング内に閉じ込めることができ、また、カプセル状のシクロデキストリンは、香辛料や香料、増粘剤といった分子を閉じ込めて安定化・物性改変できることから、食品や材料分野で応用されています。生体分子をホスト分子に閉じ込められれば、自由自在に生体分子の構造や機能を操る技術の開発につながると期待できます。しかし、従来の人工ホスト分子は大きさが小さく、内部に閉じ込められるゲスト分子の大きさは、金属イオンや小分子などの1ナノメートル以下に限られていました。精密な構造を持つ人工ホスト分子を用いて、たんぱく質のような3〜10ナノメートルサイズの巨大な分子を閉じ込めることはこれまでの技術では不可能でした。

<研究の内容>

研究チームはこれまで、直径が数ナノメートルを超え、分子量が1万を超える巨大な球構造を、金属イオンと有機化合物の配位子注2)による自己組織化を利用することで簡単で効率的に、一義構造体注3)として作り出せることを明らかにしてきました。ここで、配位子として直線ではなくわずかに角度を持つものを用いることが重要です。

今回、これらの球構造にたんぱく質を閉じ込めるために、この角度を持つ配位子にさらに工夫を施しました。それは、たんぱく質をあらかじめ配位子の1つに結合しておき、残りの配位子には糖鎖注4)を結合させておいたことです。糖鎖はたんぱく質表面と同じ親水性の物質なので、金属錯体が組み上がっていく過程でたんぱく質表面と糖鎖が相互作用し、たんぱく質が糖鎖に包まれた状態でカプセルが形成されると考えたためです。具体的には、水とアセトニトリルとの混合溶媒を入れたフラスコに、パラジウム(II)イオン(M)と、糖鎖を連結した配位子(L)、たんぱく質であるユビキチン注5)(分子量:8600)を連結した配位子(L)とを一緒に入れ、45℃で3時間程度混ぜることで、パラジウム(II)イオンと配位子が結合し、最終的には、M1223組成の中空構造の中にユビキチンを1つずつ閉じ込めた構造ができました(図1)。また、糖鎖の役割としては、組み上がったカプセルの内壁に位置して、ユビキチンの折りたたみ構造を安定化していることも考えられます。

次に、得られた構造体について、構造解析を行いました。一般的に、巨大なたんぱく質などの物質の構造を分子レベルで厳密に決定することは、構造が複雑であるため困難です。しかし、今回は人工カプセルを用いてたんぱく質を1つだけ閉じ込めることができたため、構造が一義的に定まり、また個々のたんぱく質が隔離されてたんぱく質間の相互作用が抑制されることで、詳細な構造決定が可能になりました。最先端のNMR注6)超遠心分析注7)、放射光とMEM注8)を利用した単結晶構造解析注9)と呼ばれる解析法により、世界初の「たんぱく質を丸ごと閉じ込めた人工カプセル」が、用いた原料に対して100℅の効率で生み出されたことが分かりました。

<今後の展開>

自己組織化は、思い通りに設計して複雑な構造を持つ分子を作り出すことができ、さらに、分子構造に応じた特徴的なホスト−ゲスト現象により物性を調整できる、新しいものづくりの方法です。今後、使用する配位子やその化学修飾、自己組織化条件などの検討でさまざまなたんぱく質の閉じ込めが可能になれば、たんぱく質の構造と機能の解析に応用が期待されます。例えば、生体内の環境を保ったままたんぱく質を単独で捕捉することができれば、結晶化が難しいたんぱく質でも、カプセルの構造や性質によって結晶化が可能なため、たんぱく質の解析にとって重要な結晶構造解析に革新的な進展をもたらし、創薬・生命科学分野において新しい応用に展開されることが大いに期待されます。

また、ホスト分子に閉じ込められたゲスト分子は、その構造や物性、反応性が制御されることが知られており、同様に、閉じ込められたたんぱく質に対しても高度な制御が期待されます。従って、今回の研究成果を応用することにより、たんぱく質やその部分構造の生体機能や酵素活性を人工的に精密制御したり、ホスト分子を化学修飾することによってたんぱく質を固定化・放出したりするなど、付加的な機能発現も将来的に可能になると期待できます。

<参考図>

図1

図1 カリウムイオンを選択的に閉じ込めるクラウンエーテル

図2

図2 たんぱく質を丸ごと閉じ込めた球状物質の合成方法

図3

図3

  • (左)最大エントロピー(MEM)法を併用した単結晶構造解析により明らかになったたんぱく質の電子密度マッピング。
  • (右)シミュレーションしたたんぱく質の構造。
図4

図4 単結晶構造解析に用いた単結晶の顕微鏡写真

<用語解説>

注1) 金属錯体
金属イオンと配位子とから構成される分子のこと。
注2) 配位子
金属イオンと弱い結合を作る性質を持つ分子のこと。この弱い結合が協同的に働くことによって、金属イオンと配位子とが結びつきあい、1つの球状化合物へと組み上がる。
注3) 一義構造体
構成する成分の数や集まり方が厳密に決まっており、かたち、大きさ、重さ(分子量)に一切分布を持たない、厳密に定まった構造体。
注4) 糖鎖
分子内に多数の水酸基を持つために、親水性が高く、たんぱく質の表面と親和することが期待される。
注5) ユビキチン
76個のアミノ酸からなるたんぱく質であり、さまざまな生体現象に関わることから、広く興味を持たれている。
注6) NMR(Nuclear Magnetic Resonance)
核磁気共鳴の現象を用いた測定手法。今回の研究では、溶液状態の錯体分子の構造情報が得られ、また、拡散定数を決めることで、分子の大きさを見積もることができた。
注7) 超遠心分析
重力の20万倍に及ぶ大きな遠心力のもとでの溶液状態の分子の動きを追跡することで、分子量分布や形状を決定する測定手法。今回の研究では、一義構造の分子量が得られ、またユビキチンが連結された分だけ分子量が増加したことが分かった。
注8) MEM(Maximum Entropy Method)
最大エントロピー法。実験的に得られる限られたデータから、可能な限り精密な情報を取得する情報処理の手法。今回の研究では、中空内部の弱い電子密度を定量化し、また可視化するのに役立った。
注9) 単結晶構造解析
結晶化した試料に対してX線を照射し、回折現象によって得られた反射点データから分子構造を解析する手法。今回の研究では、たんぱく質を閉じ込めたカプセル分子の立体的な分子構造を決定するのに役立った。

<論文タイトル>

“Protein encapsulation within synthetic molecular hosts”
(たんぱく質を閉じ込めたホスト分子の合成)
doi: 10.1038/ncomms2093

<お問い合わせ先>

<研究に関すること>

藤田 誠(フジタ マコト)
東京大学 大学院工学系研究科 応用化学専攻 教授
〒113-8656 東京都文京区本郷7−3−1
Tel:03-5841-7259 Fax:03-5841-7257
E-mail:
研究室ホームページ:http://fujitalab.t.u-tokyo.ac.jp

加藤 晃一(カトウ コウイチ)
自然科学研究機構 岡崎統合バイオサイエンスセンター 教授
〒444-8787 愛知県岡崎市明大寺東山5-1
Tel:0564-59-5225 Fax:0564-59-5224
E-mail:

<JSTの事業に関すること>

古川 雅士(フルカワ マサシ)
科学技術振興機構 戦略研究推進部
〒102-0076 東京都千代田区五番町7 K’s五番町
Tel:03-3512-3531 Fax:03-3222-2066
E-mail:

(英文)Success in taking a protein alive in an artificial capsule