ＤＮＡ分子バーコード法の新機能

※１） 共同研究チーム

理化学研究所 生命システム研究センター オミックス動態研究ユニット
ユニットリーダー（ＪＳＴ　さきがけ研究者）　城口 克之（シログチ カツユキ）
基礎科学特別研究員　小川 泰策（オガワ タイサク）

東海大学 医学部 基礎医学系 分子生命科学
教授　今西 規（イマニシ タダシ）
奨励研究員　キリル・クリュコフ（Kirill Kryukov）

※２） Shiroguchi, K., Jia T.Z., Sims P.A., Xie X.S. “Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single molecule barcodes”Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 1347-1352 (2012).

＜背景＞

次世代シークエンサーは、一度にたくさんの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の配列を決定することができます。この装置は、例えば、遺伝子発現量の指標となる細胞内のＲＮＡの数について、多種類の遺伝子を同時に数えることもできます。近年では、１つの細胞の中に存在する多数のＲＮＡも網羅的に計数されており、微量のＲＮＡをより正確に計数する手法の開発が求められています。

また、多くの細胞や試料からのＤＮＡを一度に計数するために、シークエンシング（配列決定）をする前に、試料ごとに異なるＤＮＡタグ（６～８塩基配列程度）を付加するマルチプレックス法^注５）が用いられています（図１）。しかし、配列決定の結果を得るまでの間に、試料とタグのペアが入れ替わる現象が見つかっており、正しい結果を得られないという問題がありました。

城口ユニットリーダーらは２０１２年に、次世代シークエンサーを利用した「ＤＮＡ分子バーコード法」を開発しました。この方法は、数えたい目的の核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）１つ１つに、それぞれ異なる配列を持つＤＮＡ分子（ＤＮＡ分子バーコード、８～２０塩基配列程度）を付加することで、目的の核酸分子を数えることができます（図２）。ＤＮＡバーコード法では、正確にデジタル計数することができるため、遺伝子発現量の解析などに応用され、これまでに多くの研究者や企業に利用され、かつ改良もされてきました。しかし、従来のＤＮＡ分子バーコード法では、次世代シークエンサーの配列決定でのエラーなどが原因で、１００個程度の分子までしか正確に数えられないという課題や、試料とタグのペアが入れ替わることに起因する複数の試料由来の結果が混ざるという問題がありました。

＜研究手法と成果＞

共同研究チームは、独自のＤＮＡ分子バーコードを設計して配列決定時などのエラーを検出したり、ＤＮＡバーコードの長さをコンピュータ上で変えるなどして計数の精度を確かめることなどにより、実験と配列情報解析法を組み合わせて、従来よりも多くの分子を正確に計数できる手法を開発しました。この手法による計数の正確さを確かめるため、既知の数の合成ＤＮＡを複数準備して次世代シークエンサーを用いて計数したところ、その計数結果が合成ＤＮＡの数とほぼ一致することが示されました（図３）。

また一度の計数で、１万個以上の核酸分子を正確に数えられることが分かりました。さらに、今回開発したＤＮＡ分子バーコード法を使うと、マルチプレックス法における試料とタグのペアの入れ替わりを見つけることができ、複数の試料由来の結果が混ざる問題が解決されました。

今回達成した１万個以上の計数という成果は、従来の手法と比べて１００倍以上も多い数になります。さらに、長さの異なるバーコードがそれぞれ計数できる最大分子数の値から推定することで、最大１０^１５個の（１，０００兆個）核酸分子をも数えることができる十分な可能性も示しました。この値は次世代シークエンサーの容量（１０^７～１０^１０個、１０００万～１００億個）を大きく超えるもので、より多くの分子を計数する目的において、今回開発されたＤＮＡ分子バーコード法は十分な役割を果たすことができます。

＜今後の期待＞

従来のＤＮＡ分子バーコードは、がん細胞、細菌叢、ウイルスの計数、リキッドバイオプシーなどへの応用研究が進んでいます。本研究で開発した分子バーコード法の応用により、より高精度の解析の実現が期待できます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） 次世代シークエンサー

サンガー法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーである「第一世代シークエンサー」と対比させて使われる用語。機種によるが、一度に１０７～１０１０（１，０００万～１００億）個のＤＮＡの配列を決定できる。以前はヒトのゲノム配列を決定するのに１４年程度かかったが、次世代シークエンサーを用いると、数日で決定できる。

注２） ＤＮＡ分子バーコード法

それぞれ異なる配列を持つＤＮＡ分子（ＤＮＡ分子バーコード）を、目的の核酸分子（ＤＮＡやＲＮＡ）の１つ１つに付加することで、核酸分子の数をデジタル的に正確に数えることができる方法（図２参照）。

注３） デジタル計数

シグナルの量にかかわらず、シグナルの有無を１または０で計数する方法。今回の例では、増幅後にある分子バーコードが検出されたら、その分子バーコードを持つＤＮＡ分子が増幅前に１つ存在したとし、増幅後に分子バーコードが検出されなかったら、その分子バーコードを持つＤＮＡ分子が増幅前に存在しなかったとして計数する（図２参照）。

注４） リキッドバイオプシー

主にがんの領域で、内視鏡や針を使って腫瘍組織を採取する従来の生検（ｂｉｏｐｓｙ）に代えて、体液サンプル（血液など）を使って診断や治療効果予測などを行う方法。

注５） マルチプレックス法

多くの試料（細胞など）由来の配列決定用ＤＮＡを一度に配列決定するための方法。配列決定用ＤＮＡに、試料ごとに異なるＤＮＡタグ（６～８塩基配列程度）を付加し、すべての試料由来の配列決定用ＤＮＡを混ぜて配列決定をする。配列決定度、ＤＮＡタグの配列から、核配列決定用ＤＮＡがどの試料由来であったかを識別する。

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