ヒト、サル、マウスにおける多能性“発生座標”の解明
～ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の実態を特定～

ポイント

• サル着床前後胚の遺伝子発現動態を網羅的に解明。
• ヒトｉＰＳ細胞は着床後約１週間のサル多能性細胞と同等の遺伝子発現を示す。
• 霊長類多能性幹細胞の特性を診断する遺伝子セットの特定。
• 霊長類とマウスの発生過程における多能性制御の相違を解明。

＜研究の背景＞

哺乳類の初期胚研究、特に着床後胚を対象としたものは、技術的および倫理的な問題からほぼ全てマウスを用いて行われています。ヒトを含む霊長類の着床後胚は、円錐型のマウス胚とは異なり、円盤状の形態を示すことが知られています。しかし霊長類に関してはこれ以上の知見はなく、特に分子生物学的な知見は皆無です。ＥＳ細胞といった多能性幹細胞は着床前胚から樹立され、マウスＥＳ細胞やそれと同等のマウスｉＰＳ細胞はナイーブ型状態といわれる広い分化多能性を示すことから、ヒトも多能性幹細胞も同様であると考えられ、再生医療への応用が期待されています。しかしヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞は、その形態といくつかの特徴から、いわゆるプライム型という、より分化能の制限された状態にある可能性が示されており、初期胚との比較によるその実態の解明が待たれてきました。

＜研究手法・成果＞

研究グループは、独自に開発した単一細胞全遺伝子発現解析法であるＳｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ　ｍＲＮＡ　３’ｓｅｑｕｅｎｃｅ法（ＳＣ３－ｓｅｑ法^注８））を用いて、カニクイザル初期胚における遺伝子発現動態を調べました。カニクイザルは、オナガザルの一種であるアカゲザルやニホンザルの近縁種で、ヒトとは約２５００～３０００万年前に分離したと考えられています。また、ヒトでは受精後６～７日で着床が起こりますが、カニクイザル胚は受精後約９～１０日に着床します。研究グループは着床前後の６日齢から１７日齢までにおける胚の状態を調べました。その結果、カニクイザルでは７日齢頃から将来体の全ての細胞に分化するエピブラストが形成され、着床後原腸陥入が起こりつつも、マウスに比べ１週間以上も安定して多能性状態を維持していることが分かりました。マウスとサルのエピブラストは、どちらも広範な多能性を維持していますが、それぞれの発生段階において似た挙動を示す遺伝子と異なる挙動を示す遺伝子があることも明確になりました。また、サルエピブラストの多能性状態はマウスにおける原腸陥入前の多能性状態に近いにもかかわらず、一部神経分化に特徴的な遺伝子の発現が観察されました。さらに、これらのデータを用いてカニクイザルエピブラストの発生に特徴的な遺伝子群を抽出し、それらの発現をサルＥＳ細胞やヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞において調べたところ、どちらの細胞も着床後約１週間のサル胚と同等な遺伝子発現を示すことが判明しました。これによりヒト、サル、マウスの三種における発生座標の位置関係が明らかになり、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞はマウスにおけるナイーブ型とプライム型多能性の中間の状態に位置することが分かりました。この結果は、霊長類のＥＳ／ｉＰＳ細胞がマウスプライム型多能性幹細胞より広範な分化能を持つ可能性を示しています。

＜波及効果、今後の予定＞

本研究では、霊長類多能性状態の包括的な分子動態を明らかにし、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の実態を特定することに成功しました。学術的な観点からは、ヒト胚発生学において大きく欠落した知見を補完し、さらには哺乳類種間の違いに対する進化学的研究の発展に寄与すると期待されます。また応用面では、着床前後の不妊症発症メカニズムの解明への貢献、多能性維持機構の解明や制御、分化誘導のより精密な制御を目指す研究などの基盤が形成され、ヒト多能性幹細胞を用いた医療や創薬の促進が期待されます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） カニクイザル（Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ，　英名Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍａｃａｑｕｅ、Ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ　ｍｏｎｋｅｙ）

哺乳綱霊長目オナガザル科マカク属に分類される旧世界サルの一種。主にフィリピンなど東南アジアに生息している。同属にはアカゲザルやニホンザルが含まれ、ヒトやチンパンジー、オランウータンといったヒト科の霊長類とは約２５００～３０００万年前に分離したと考えられている。現在ヒトを含む霊長目発生機構のモデル生物として使用され、ヒトの初期発生や生殖細胞に関わる新たな知見が得られると期待される。

注２） 単一細胞遺伝子発現解析法

１細胞由来の転写産物を増幅し、発現している遺伝子をマイクロアレイや次世代シークエンサーを用いて全ゲノムレベルで解析する手法。従来の全遺伝子発現解析では数十万個以上の細胞数が必要であったが、近年の目覚ましい技術発展により単一細胞においても全遺伝子レベルで解析可能になった。一言に単一細胞遺伝子発現解析法といっても様々な方法があり、後述のＳＣ３－ｓｅｑ（注８参照）は単一細胞遺伝子発現解析法の一種である。

注３） ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞

胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）と人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ）のこと。どちらも様々な細胞に分化する能力を持つ多能性幹細胞（注６参照）の一種であり、無限増殖能や広範な分化能を持つ。ＥＳ細胞は受精卵より作り出され、ｉＰＳ細胞は体細胞に特定の因子を導入することで作り出される。マウスにおいてＥＳ／ｉＰＳ細胞は、生殖細胞を含む成体全ての細胞に分化する能力を持つことが知られている。

注４） ナイーブ型、プライム型

多能性の状態を示す。プライム型の多能性とは、ＥｐｉＳＣ細胞（注５参照）に代表される細胞の持つ多能性で、三胚葉［内胚葉（消化管など）、中胚葉（血液、筋肉、骨、腎臓など）、外胚葉（神経、表皮など）］系統に分化する能力は持つが、生殖細胞分化能は低い、もしくは無いとされる。ナイーブ型の多能性とは、現在のところ、げっ歯類（マウス、ラット）のＥＳ細胞やｉＰＳ細胞でのみ報告されている多能性で、三胚葉系統に分化する能力に加え、生殖細胞分化能も持つ多能性のこと。

注５） エピブラスト、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ、Ｅｐｉｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）

エピブラストは、胚体外胚葉もしくは胚盤葉上層とも呼ばれる。胚発生初期に一過的に出現し、成体を形成する全ての細胞に分化する多能性を持った細胞。エピブラスト幹細胞は、マウス着床後のエピブラストから樹立された多能性幹細胞の一種。形態やその他の特徴がマウスＥＳ／ｉＰＳ細胞とは大きく異なり、生殖細胞分化能は低い、もしくは無いが、三胚葉分化能は持つ。

注６） 多能性幹細胞

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含む多能性を持つ幹細胞。幹細胞とは分裂して自分と同じ細胞を作る自己複製能と、分化した細胞を作る能力を有する細胞であり、特に多能性幹細胞は体を構成するすべての種類の細胞に分化する能力を持つ細胞と定義される。

注７） 原腸陥入

胚発生初期において三胚葉を形成するための重要なイベント。哺乳類では、エピブラスト（注５参照）後方より腹側へ細胞が陥入する。陥入した細胞は主に中胚葉と内胚葉に寄与し、背側に残る細胞は主に外胚葉を形成する。カニクイザルでは１２日齢前後に、マウスでは６日齢頃に起こることが知られている。

注８） Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ　ｍＲＮＡ　３’ｓｅｑｕｅｎｃｅ法　（ＳＣ３－ｓｅｑ法）

単一細胞遺伝子発現解析法（注２参照）の一種。従来の方法では転写産物の全長を検出しようと設計されていたが、単一細胞由来の極微量サンプルではなかなかうまくいかなかった。ＳＣ３－ｓｅｑでは全長ではなく、転写産物の末端部分のみを検出するよう設計した。これによって検出精度と再現性の上昇、またコストを抑制することが可能となった。

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