バイオ燃料として期待される微細緑藻から
新規炭化水素生合成酵素遺伝子の特定に成功

ポイント

• バイオ燃料源として期待される微細緑藻Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｂｒａｕｎｉｉのＬ品種から、リコパジエンという炭化水素の生合成に関わる新規酵素を特定した。
• 今まで全く不明だった、リコパジエンの生合成メカニズムの一端が明らかになった。
• 本研究により、効率の良いバイオ燃料生産技術の開発に繋がることが期待される。

＜発表内容＞

Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉは世界各地の淡水に住む単細胞性の微細緑藻で、個々の細胞を細胞外マトリクスによりつなぎ止めて群体を形成します（図１）。この微細藻は光合成により固定した炭素を、液状炭化水素に変換して蓄積します。その炭化水素含量は、株によっては乾燥重量の数十％にも達することから、燃やしても大気中の二酸化炭素量を増加させない、再生産可能な代替燃料としての利用が期待されています。本藻種には、生産する炭化水素のタイプが異なる、Ａ、ＢおよびＬの３品種があります。Ａ品種は直鎖状アルケン類を、Ｂ品種はボツリオコッセン類およびメチルスクアレン類というトリテルペン^注１）系炭化水素を、Ｌ品種はリコパジエンというテトラテルペン系炭化水素を生産します（図２）。これらの炭化水素は細胞内で生産された後、細胞外に分泌され、細胞外マトリクス部に蓄積されます。一度細胞外に分泌された炭化水素が藻の細胞内に再び取り込まれ、例えば栄養源として利用されるといった現象は確認されていません。さらに炭化水素という点では共通しているものの、同一種とされる本藻が、品種の違いにより全く異なる化合物を蓄積する点も不思議であり、本藻種における炭化水素の存在意義はいまだ謎です。

本藻種が生産する炭化水素のうち、Ｂ品種が生産するトリテルペン系炭化水素については、その生合成酵素が特定されています（Ｎｉｅａｈａｕｓ　ｅｔ　ａｌ．２０１１）。それに対し、Ｌ品種におけるリコパジエン生合成機構の詳細は不明でした。リコパジエンは炭素数４０で、分子内に２つの二重結合を有する対称形をしています。この構造から炭素数２０で二重結合を４つ有するゲラニルゲラニル二リン酸（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ＝ＧＧＰＰ）が２分子縮合して、まず二重結合を８つ有するリコパオクタエンが作られ、その後、段階的に二重結合が還元されて最終的にリコパジエンまで変換される（図３、経路Ａ）のか、炭素数２０で二重結合を１つだけ有する、フィチル二リン酸（ｐｈｙｔｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ＝ＰＰＰ）が２分子縮合して、直接リコパジエンが作られる（図３経路Ｂ）のかが分かりませんでした（図３）。そこでＬ品種の炭化水素組成を精査したところ、主成分であるリコパジエンの他にも、炭素数４０で二重結合を６、５、４あるいは３個有する生合成中間体と考えられる炭化水素も、微量成分として存在することが分かり、リコパジエンは経路Ａにより生成することが示されました。放射性同位体で標識したゲラニルゲラニオールを、培養中のＬ品種に取り込ませると、上記中間体に加えて、放射性のリコパジエンが生成することも、経路Ａの正しさを支持しました。またＬ品種の藻体粗抽出物を、放射性同位体で標識したＧＧＰＰ、あるいはＰＰＰとともに混ぜて放置すると、ＧＧＰＰからは効率良く放射性リコパオクタエンが生成されましたが、ＰＰＰからの放射性リコパジエンの生成は、殆ど検出できませんでした。次にＧＧＰＰを基質としてリコパオクタエンを生成する酵素を特定するために、Ｌ品種のトランスクリプトーム解析^注２）を行ったところ、スクアレン合成酵素（ｓｑｕａｌｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ＝ＳＳ）に似た酵素遺伝子が２種類発現していました。そこでこれらの遺伝子を大腸菌で発現させ、得られたリコンビナントタンパク質^注３）の酵素活性を調べると、一方は炭素数１５のファルネシル二リン酸から炭素数３０の炭化水素であるスクアレンを生じるＳＳでしたが、もう一方はＧＧＰＰからリコパオクタエンを生産するリコパオクタエン合成酵素（ｌｙｏｃｏｐａｏｃｔａｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ＝ＬＯＳ）でした。興味深いことにＬＯＳは、本来の基質と考えられるＧＧＰＰだけでなく、スクアレンの前駆体であるファルネシル二リン酸（ｆａｒｎｅｓｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ＝ＦＰＰ）も基質とすることができ、ＦＰＰのみが存在する時はスクアレンを、ＧＧＰＰとＦＰＰの両者が存在する時はスクアレンとリコパオクタエンに加えて、炭素数３５の「ハイブリッド型」の炭化水素も生産しました（図４）。この基質特異性の低い酵素反応は、試験管内での実験系のみならず、藻体内でも起きていることが、炭素数３５の炭化水素が藻体内に少量存在している事からも示されました。今回の研究により、Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉのＬ品種がリコパジエンを生産するメカニズムの重要なステップが明らかにできたことから、今後、さらに研究を進めることにより、Ｌ品種における炭化水素生合成の全体像を解明できることが期待されます。

Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉのＢ品種に続き、Ｌ品種の炭化水素生合成に関わる酵素遺伝子を特定できたことで、本藻種が「何故テルペン系炭化水素を作るのか？」という問いに対する答えを見つける手がかりが得られました。本藻種が炭化水素を必要とする理由の解明と炭化水素合成に適した培養方法の開発等により、本藻種からの代替燃料生産への貢献が期待できます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） トリテルペン

テルペンはテルペノイド、イソプレノイドとも呼ばれ、炭素数５のイソプレンを構成単位とする一群の天然有機化合物の総称。このうちトリテルペンは６個のイソプレン単位、すなわち炭素数３０の基本骨格、テトラテルペンは８個のイソプレン単位、すなわち炭素数４０の基本骨格を持つものを指す。

注２） トランスクリプトーム解析

ゲノムＤＮＡ上に記録されている遺伝子情報のうち、ある状態の細胞においてメッセンジャーＲＮＡとして発現しているものにつき、網羅的にそれらの塩基配列および存在量を調べること。

注３） リコンビナントタンパク質

あるタンパク質をコードしている遺伝子を、人為的に細胞内（大腸菌、酵母等の単細胞生物や、動植物の細胞）に導入し、発現させることにより得られるタンパク質のこと。

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