共同発表：ヒト培養細胞内でたんぱく質の大量合成に成功～環状ｍＲＮＡを用いた終わりのない回転式たんぱく質合成反応を実現～

ポイント

ヒト培養細胞内で、環状ｍＲＮＡを鋳型としたたんぱく質の大量合成に成功した。
環状ｍＲＮＡはたんぱく質合成のためにキャップ構造やポリＡ鎖を必要としない。
たんぱく質の新しい大量合成法として、産業・医療応用が期待される。

ＪＳＴ戦略的創造研究推進事業において、名古屋大学大学院理学研究科の阿部洋　教授（理化学研究所伊藤ナノ医工学研究室　客員主管研究員）、阿部奈保子　博士研究員らは、ヒト培養細胞内で環状ｍＲＮＡ^注１）から終わりのないたんぱく質合成が起きることを見いだしました。

産業や医療への利用を視野に、真核生物^注２）においてたんぱく質を大量合成する技術の開発が望まれていました。しかし原核生物^注２）とは異なり、真核生物のたんぱく質合成系は複雑な構成要素からなるため、いまだにそのメカニズムは完全には明らかになっていません。真核生物のたんぱく質合成系で鋳型となるｍＲＮＡは通常は線状（直鎖型）で、その末端には特別な構造（キャップ構造やポリＡ鎖^注３））を持ち、この構造が目印となり、たんぱく質合成反応が開始の目印（開始コドン^注４））から終了の目印（終止コドン^注４））まで起こります。

阿部教授らは、ｍＲＮＡからキャップ構造やポリＡ鎖を除き、さらに終止コドンを除いた環状ｍＲＮＡを合成しました。それをヒト培養細胞内に導入したところ、環状の鋳型に沿って終わりなく続く回転式たんぱく質合成反応が起こり、たんぱく質を大量に合成できました。以前の研究で原核生物においても同様な現象が見られることから、本現象はたんぱく質合成反応における普遍的なものであることが示されました。本手法は、たんぱく質の大量生産法としての産業応用や、安全性の高いたんぱく質補充療法^注５）として医療応用されることが期待されます。

本研究成果は、２０１５年１１月１０日（英国時間）に英国科学誌「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ」のオンライン速報版で公開されます。

本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。

戦略的創造研究推進事業

研究領域	「脳神経回路の形成・動作と制御」（研究総括：村上富士夫　大阪大学大学院生命機能研究科　特任教授）
研究課題名	「シナプス可塑性に関わるＲＮＡ群の革新的イメージング法の開発」
研究者	阿部洋（名古屋大学大学院理学研究科　教授）
研究期間	平成２３年１０月～平成２７年３月

＜研究の背景と経緯＞

たんぱく質合成は、リボソーム^注６）と呼ばれるたんぱく質の複合体が、鋳型であるｍＲＮＡ上を移動し、アミノ酸をつないでいく反応です。自然界では通常、線状（直鎖状）のＲＮＡが鋳型に用いられ、たんぱく質合成反応は開始コドンに始まり終止コドンに終わります。

２０１３年に阿部教授らは、原核生物である大腸菌のたんぱく質合成系において、終止コドンを除いた環状ｍＲＮＡを鋳型として用いたたんぱく質合成反応について検討しました（図１）。その結果、通常の直鎖状ｍＲＮＡと比較し、環状ｍＲＮＡからは大量のたんぱく質を合成できることを明らかにしました（参考文献）。

この結果は以下のような原理に基づくと考えられます。通常のたんぱく質合成反応は、開始、伸長、終止の３つの段階に大きく分けられます。直鎖状ｍＲＮＡを鋳型とするたんぱく質合成反応では、反応１回ごとにリボソームが鋳型へ結合、解離を行います（図２）。しかし環状ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、終止コドンを除けば、リボソームが一度結合してたんぱく質合成が開始すると、ＲＮＡ配列に終わりがないため、永久に反応が続くと予想されます。

また、たんぱく質合成反応で最も時間のかかる段階（律速段階）は、多数のたんぱく質やリボソームが集合し翻訳開始複合体を形成する開始段階にあると考えられています（図３）。しかし、環状ｍＲＮＡを鋳型に用いた場合、律速となる開始段階は最初の一度のみで、それ以降は伸長反応が効率よく進行します。そのため、「終わりのない回転式たんぱく質合成反応」は高効率なたんぱく質合成法となる可能性を秘めていました。

＜研究の内容＞

原核生物での結果を受け、本研究では真核生物においても同じ現象が起こるかを検討しました。真核生物におけるたんぱく質合成のメカニズムは原核生物よりはるかに複雑で、その分子メカニズムの詳細はいまだに明らかになっていません。

真核生物では、原核生物と異なりｍＲＮＡの５’末端にキャップ構造が、３’末端にポリＡ鎖があります（図３）。直鎖状ｍＲＮＡを鋳型としたたんぱく質合成反応の開始では、さまざまなたんぱく質がキャップ構造およびポリＡ鎖に結合し、これらのたんぱく質同士が相互作用することで、ＲＮＡが環状構造を取ります。この構造をリボソームが認識し結合することで、開始コドンからたんぱく質合成反応が開始すると考えられています。この複合体形成が反応開始に必要なことから、真核生物では鋳型となるｍＲＮＡには末端が必要であると理解されています。一般に、末端からではなくＲＮＡの途中からたんぱく質合成が起こる場合には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）^注７）と呼ばれる特殊なＲＮＡ領域が必要と考えられていました。

阿部教授らはキャップ構造、ポリＡ鎖やＩＲＥＳ配列を持たずに、かつ開始コドンを持ち、終止コドンを持たない環状ｍＲＮＡを設計しました（図４ａ）。これは大腸菌のたんぱく質合成系で用いた「終わりのない回転式たんぱく質合成反応」と同じ設計指針です。この環状ｍＲＮＡが真核生物たんぱく質合成系の鋳型として働くかを検討しました。

まず始めに、８アミノ酸配列からなるＦＬＡＧペプチド^注８）の鋳型配列を複数個含む環状ｍＲＮＡを設計・合成しました（図４ａ）。コザック配列^注９）およびＦＬＡＧ鋳型配列からなる長さの異なる３つの環状ｍＲＮＡ（１２９、２５８、３８７ヌクレオチド長）を合成し、ウサギ赤血球由来の無細胞たんぱく質合成系におけるたんぱく質合成反応を解析しました。その結果、直鎖状ｍＲＮＡでは短いたんぱく質の合成が確認されたのに対し、環状ｍＲＮＡでは長いたんぱく質の合成が確認されました。このとき、３つの長さの異なる環状ｍＲＮＡのうち、ＦＬＡＧ鋳型配列を８つ含む２５８ヌクレオチド長の環状ｍＲＮＡ（８ｘＦＬＡＧ環状ＲＮＡ）で最も合成産物が多く生じました（図４ｂ）。そこで、次に、この８ｘＦＬＡＧ環状ＲＮＡをヒト培養細胞であるＨｅＬａ細胞^注１０）に導入し、生きた細胞内でたんぱく質が合成されるかどうかを検討しました（図５）。その結果、生きたＨｅＬａ細胞内においても環状ｍＲＮＡからは長いたんぱく質が合成されること、また直鎖状ｍＲＮＡに比較し大量のたんぱく質が合成されることが分かりました。

続いて、異なる配列を持つ数種類の環状ｍＲＮＡを合成し、その配列がたんぱく質合成反応に及ぼす影響を調べました。その結果、ＲＮＡ配列が高次構造を生じにくいと考えられる配列ほど回転式たんぱく質合成反応の産物を多く生じました。また、終止コドンを含む環状ｍＲＮＡからは翻訳産物が検出されませんでした。最適なコザック配列を持つ環状ｍＲＮＡは、弱いコザック配列を持つ環状ｍＲＮＡよりも産物が多く生じました。

以上の結果は、合成した環状ｍＲＮＡでは鋳型配列の終わりがないために、大量のたんぱく質が合成されたことを示します。真核細胞のシステムでは環状ｍＲＮＡ上における合成開始反応は通常起こりにくいと考えられますが、一度開始されれば無限に続く鋳型配列に沿って反応が続き、その結果大量のたんぱく質を合成できます。また、環状ｍＲＮＡは直鎖状ｍＲＮＡと比較して生体内で分解されにくいことが知られています。この特性も長期的なたんぱく質合成に有利に作用します。「終わりのない回転式たんぱく質合成」は、原核生物および真核生物に普遍的な現象であることが示されました。

＜今後の展開＞

今回の研究により、終止コドンを持たない環状ｍＲＮＡをヒト培養細胞内に導入することで、終わりのない回転式たんぱく質合成反応が起こり、高い効率でたんぱく質が合成できることを示しました。本手法は、真核生物のたんぱく質合成開始のメカニズムの解明に役立ちます。また、コラーゲンや蜘蛛の糸などの反復配列があるたんぱく質を大量合成して医療材料としたり、遺伝子治療に代わって生体内で安全にたんぱく質を合成させる手法として、産業および医療応用されることが期待されます。さらに、終わりのない回転式たんぱく質合成分子はシグナル増幅反応として利用することが可能です。例えば、蛍光シグナルを増幅することで神経細胞における微量ＲＮＡのイメージングに応用されることが期待されます。

＜参考図＞

図１　環状ＲＮＡを用いた終わりのない回転式たんぱく質合成現象

終止コドンがなく連続的な鋳型配列を持つ環状ＲＮＡを鋳型にしたとき、リボソームはいったん反応を開始すると、永久にたんぱく質を合成し続ける。反復配列を持つ非常に大きなたんぱく質が合成される。

図２　線状ｍＲＮＡを鋳型とする通常のたんぱく質合成反応

リボソームは、ｍＲＮＡの５’末端を認識した後、開始コドン上でリボソーム複合体を形成する。この段階が反応中で最も時間がかかる律速段階と考えられている。続いてコドンに従がってたんぱく質合成を進めていく。終止コドンに到達すると、リボソームは解離し、次の反応に向かう。

図３　キャップ構造とポリＡ鎖を両端に持つ線状ｍＲＮＡにおける翻訳開始複合体形成の模式図

ポリＡ結合性たんぱく質（Ｐｏｌｙ（Ａ）－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＢＰ）や種々の真核生物型翻訳開始因子（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ：ｅＩＦ）が相互作用をして、ｍＲＮＡの５’末端で複合体を形成する。

図４　２５８塩基長の環状ＲＮＡデザインとウェスタンブロット解析

（ａ）ＦＬＡＧ鋳型配列を８個含む２５８塩基長の環状ＲＮＡ（８×ＦＬＡＧ環状ＲＮＡ）の模式図（ｂ）ヒト由来ＨｅＬａ細胞に導入し合成産物を検出した（抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出した結果）。環状ＲＮＡを細胞内に導入した場合にのみ、高分子量領域にバンドが検出された。ウェスタンブロット解析は、電気泳動によって分離したたんぱく質を膜に転写し、目的とするたんぱく質に対する抗体を用いて、そのたんぱく質を検出する解析方法である。

図５　たんぱく質翻訳産物の蛍光イメージング

環状ＲＮＡ（８×ＦＬＡＧ環状ＲＮＡ）をヒト由来ＨｅＬａ細胞に導入後、細胞内における合成産物を検出した（抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫染色の顕微鏡観察結果）。線状（直鎖状）ＲＮＡを導入した場合と比較し、環状ＲＮＡを導入した場合により強い染色が観察された。

＜用語解説＞

注１）環状ｍＲＮＡ: 線状（直鎖状）ＲＮＡの末端同士が共有結合し環状になったｍＲＮＡ。近年、生体内にも環状ｍＲＮＡが存在していることが明らかになり、その機能や生成メカニズムに注目が集まっている。
注２）真核生物、原核生物: 真核生物とは、動物、植物、菌類、原生生物など、身体を構成する細胞の中に細胞核と呼ばれる細胞小器官を持つ生物。原核生物とは、核膜を持たず、従がって明確な輪郭を持った細胞核の見られない細胞からなる生物（真正細菌および古細菌）のこと。
注３）キャップ構造、ポリＡ鎖: 真核生物のｍＲＮＡが５’末端と３’末端にそれぞれ持つ構造のこと。キャップ構造とは、５’末端塩基の三リン酸にメチルＧＴＰが５’−５’向きに結合したもので、ＲＮＡの５’末端の保護や翻訳を補助する働きを持つ。ポリＡ鎖とはＲＮＡの３’末端にアデニン塩基が連なったもので、ｍＲＮＡを細胞質での分解から保護し、転写終結、核外輸送、翻訳を補助する働きを持つ。
注４）開始コドン、終止コドン: 遺伝暗号は３塩基の配列を１組としたコドンによってアミノ酸を指定する。６４種類あるコドンのうち、開始コドンと呼ばれるＡＵＧからｍＲＮＡの翻訳が開始され、終止コドンと呼ばれるＵＡＧ、ＵＧＡ、ＵＡＡによって翻訳が停止する。開始コドン（ＡＵＧ）はアミノ酸の１つであるメチオニンをコードするが、終止コドン（ＵＡＧ、ＵＧＡ、ＵＡＡ）はアミノ酸をコードしていない。
注５）たんぱく質補充療法: その不足が病気・症状の原因となっているたんぱく質（酵素など）を外部から補うことで改善を図る治療法。
注６）リボソーム: ｍＲＮＡ上を移動し、ｍＲＮＡの配列情報を読み取ってたんぱく質を合成する場。たんぱく質（リボソームたんぱく質）とＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）から構成されている。
注７）配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）: ｍＲＮＡ内部のリボソーム進入サイト。主にウイルス由来のＲＮＡ配列で複雑な二次構造を形成し、リボソーム結合性を持つ。ＩＲＥＳのすぐ下流からの翻訳反応開始を促進する。
注８）ＦＬＡＧペプチド: ８つのアミノ酸、Ａｓｐ（アスパラギン酸）－Ｔｙｒ（チロシン）－Ｌｙｓ（リシン）－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓからなるペプチド。結合親和性が高い抗体を用いてたんぱく質の標識や精製のための指標に使用される。
注９）コザック配列: 真核生物のｍＲＮＡに見られる共通配列で、開始コドンおよびそれに隣接するヌクレオチド配列。たんぱく質合成反応の開始に関与することが知られている。
注１０）ＨｅＬａ細胞: 試験管内で細胞を用いる試験や研究に幅広く用いられている、ヒト由来の細胞株。子宮頸がんの腫瘍病変から分離され株化されたもの。

＜論文タイトル＞

“Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells”
（ヒト生細胞内における環状ＲＮＡのローリングサークル翻訳反応）
Abe, N., Matsumoto, K., Nishihara, M., Nakano, Y., Shibata, A., Maruyama, H., Shuto, S., Matsuda, A., Yoshida, M., Ito, Y. and Abe, H.
doi ：10.1038/srep16435

＜参考文献＞

“Rolling Circle Amplification in a Prokaryotic Translation System Using Small Circular RNA”
（小さな環状ＲＮＡを利用した原核生物翻訳系におけるローリングサークル増幅反応）
Abe, N., Hiroshima, M., Maruyama, H., Nakashima, Y., Nakano, Y., Matsuda, A., Sako, Y., Ito, Y. and Abe, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 2004
doi ：10.1002/anie.201302044