ポイント
- 海や川などに生息する魚の種類を調べるには大きな労力と費用がかかっていた。
- 環境ＤＮＡから魚種を判定できる技術を開発し、その性能を水族館で検証した。
- 将来、魚を捕獲せずに魚類多様性のモニタリングが可能になる。
ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業（ＣＲＥＳＴ）の一環として、千葉県立中央博物館の宮 正樹 主席研究員、東北大学、東京大学、沖縄美ら島財団、神戸大学、龍谷大学、北海道大学からなる研究グループは、魚から体表の粘液や糞などとともに水中に放出されたＤＮＡ（環境ＤＮＡ）を分析することによって、ＤＮＡを放出した魚の種類を判定する技術を開発しました。
海や川や湖沼に生息する魚の種類を調べるには、水中に潜って魚を観察したり、網などの漁具を使って魚を捕るなど、多大な労力と費用がかかる上に長期間にわたる調査が必要でした。さらに、日本に生息が確認されている魚だけでも４，０００種以上いるため、目視や標本の観察により魚の種類を決めるためには、高度な専門的知識と経験が必要でした。近年、魚を含む生物の体表の粘液や糞などとともに放出されたＤＮＡが水中をただよっていることが明らかになり、「環境ＤＮＡ」と呼ばれて注目を集めています。現在、ＤＮＡは「商品のバーコード」のように簡単に読み取ることができ、しかも読み取った情報（ＤＮＡの塩基配列注１））から魚の種類が分かります。今回の研究では、微量な環境ＤＮＡから魚の種類が分かる部分を選択的に増幅し、それを最新の機器で分析してＤＮＡの塩基配列を読み取り、ＤＮＡを放出した魚の種類を判定する技術を開発しました。この技術を使えば、魚に関する専門的な知識がなくても、水をくんでＤＮＡを分析するだけで、生息する魚の種類をわずか数日間の実験と解析で推定できます。従来の手法（目視や漁獲）では実現できなかった魚類多様性のモニタリングを、大きな労力と時間をかけずに長期間かつ広範囲に行うことを可能にした画期的な手法となることが期待されます。
本研究成果は７月２２日（英国時間）に英国科学雑誌「Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｏｐｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」で公開されます。
本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。
戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）
| 研究領域 |
「海洋生物多様性および生態系の保全・再生に資する基盤技術の創出」
（研究総括：小池 勲夫 東京大学 名誉教授） |
| 研究課題名 |
「環境ＤＮＡ分析に基づく魚類群集の定量モニタリングと生態系評価手法の開発」 |
| 研究代表者 |
近藤 倫生（龍谷大学 理工学部 教授） |
| 研究期間 |
平成２５年１０月～平成３０年３月 |
ＪＳＴはこの領域で、海洋の生物多様性および生態系を把握するための先進的な計測技術と将来予測に資するモデルの研究開発を行い、これらを保全・再生するために必要な基盤技術を創出することを目的とします。本研究は、この目的を達成するために、環境ＤＮＡを利用した魚類多様性モニタリング手法の開発を目指します。
＜研究の背景と経緯＞
生物多様性の保全や持続可能な生物資源の利用に関する施策を推進することを目的として２００８年に「生物多様性基本法」が制定され、その成立を受けて２０１０年に「生物多様性国家戦略２０１０」が閣議決定されました。この施策を推進するための基盤となる技術の１つが生物多様性のモニタリングです。ところが、海や川や湖沼で魚の多様性をモニタリングしようとすると、水中に潜って観察したり網などの漁具を使って捕るなど、大きな労力と費用に加えて長期間にわたる調査が必要でした。さらに、日本に生息が確認されている魚だけでも４，０００種以上いるため、目視や標本の観察により魚の種類を決めるためには、高度に専門的な知識と経験が必要でした。
一方、魚を含む生物の体表の粘液や糞などとともに放出されるＤＮＡが水中をただよっていることが最近になって明らかになり、「環境ＤＮＡ」と呼ばれて大きな注目を集めています。ＤＮＡの塩基配列には生きものの種類が分かる情報が含まれており、その情報を読み取ることによりさまざまな応用が可能になるからです。実際、環境ＤＮＡは外来魚であるブルーギルのすむ溜め池の検出、河川に生息するコイの生物量の測定、さらには特別天然記念物であるオオサンショウウオの生息地の検出などに使われ、日本でも注目すべき成果が上がっています。
環境ＤＮＡには特定の魚のＤＮＡだけでなく、多様な生物のＤＮＡが含まれています。これらを同時並行的に分析する技術を開発すれば、今まで労力や時間や費用の点から困難だった魚類多様性のモニタリングが可能になります。環境中のＤＮＡをまとめて分析して生物の種類を判定する技術は「メタバーコーディング」と呼ばれており、次世代シーケンサー注２）という最新の分析機器を使ったシステムが、主に微生物を対象にして確立されてきました。この技術を魚の環境ＤＮＡに応用する上での問題は、魚の種を特定できるＤＮＡを環境水から選択的に取り出す技術を確立することでした。本研究は、世界に先駆けて「魚類メタバーコーディング」の技術を開発し、沖縄美（ちゅ）ら海水族館の４つの水槽の水を使ってその性能を検証しました。
＜研究の内容＞
魚類のメタバーコーディングを成功させるためには、①どんな魚にも共通する２つの保存的な領域をＤＮＡの塩基配列から探し出さなければなりません。同時に、②その領域に挟まれるＤＮＡの塩基配列は魚の種類が識別可能な十分な「違い」を持っていなければなりません。さらに、③環境ＤＮＡは劣化が進んでいることが多く、②の領域の長さは短い方が望ましいと考えられています。
本研究では、これら３つの条件を満たす領域を、魚類８８０種から得られたミトコンドリアゲノム注３）全長配列を比較することにより探し出しました。上記①の保存的領域に結合する一対のプライマー注４）（短い一本鎖ＤＮＡ）を設計すれば、プライマーがあらゆる魚のメタバーコーディング領域に結合します。そして、そこを起点にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）注５）でＤＮＡを増幅すれば、２つのプライマーとそれらに挟まれる②の可変領域が必要量得られます。さらに、プライマーにさまざまなアダプターと呼ばれる配列をつけることにより、次世代シーケンサーで大量のサンプルを超並列分析できるようにしました。
最初に、世界の魚類３０，０００種の多様性を代表する９６種注６）を選び、その組織から抽出したＤＮＡを用いてこれらプライマーの性能を検証しました。その結果、いずれの種からも良好なＰＣＲ産物が増幅されました。次に、沖縄美ら海水族館の４つの水槽水（２～１０リットル）から抽出したＤＮＡを増幅して次世代シーケンサーで分析しました。その結果、４つの水槽に飼育されている魚類の９割を越す１６８種の検出（９３．３％）に成功しました（比較参照のためのＤＮＡの塩基配列がないものは除く）。また、隣接するサンゴ礁域からとった天然海水からも亜熱帯性魚類９３種を検出しました。両者を合わせると、重複するものを除いてサンゴ礁から深海にかけてのさまざまな環境に生息する魚類計２３２種（７０科１５２属）を検出できたことになります 図１)。
＜今後の展開＞
今回開発した手法は、水をバケツ１杯程度の数リットルをくんでろ過すれば、後はＤＮＡを抽出して分析するだけの非常に簡単なものです。現在、リファレンスとなるＤＮＡデータ（比較参照のためのＤＮＡの塩基配列）は５，０００種近くを網羅していますが、魚類は世界で３０，０００種以上います。このリファレンスデータがさらに充実すれば、魚類に関する専門的知識がなくても世界中の海や川で魚類相の調査を行うことができます。従来の手法（目視や漁獲）では、労力や時間や費用の点で実現できなかった魚類多様性のモニタリングが「いつでも」「どこでも」容易にできるようになったという点で画期的です。
今回開発した技術では、１回の分析で１，０００サンプル以上（１，０００箇所以上の水）のデータを得ることが可能です。将来的には、特定地域の魚類相をさまざまな時間スケール（たとえば毎時・毎日・毎週）でモニタリングしたり、さまざまな空間スケールの魚類相（たとえば日本全国・全世界）を同時多地点でモニタリングするなど、これまでの手法では考えられなかった規模でのモニタリングが可能になります。生物多様性モニタリングにビッグデータの時代が来たと言っても過言ではありません。
さらに、深海や未踏の地など魚類相が明らかになっていない水域で調査を行えば、未知の魚の検出が可能に、あるいは、既知の魚でも未知の生息地を発見することが可能になります。今後の幅広い応用範囲に注目すべき手法です。
＜参考図＞
図１
沖縄美ら海水族館の黒潮水槽、熱帯魚水槽、深層水槽、マングローブ水槽で検出された種数と飼育された魚でリファレンスとなるＤＮＡの塩基配列を持つ種の比。括弧内の数字はそのパーセンテージ。
参考写真 沖縄美（ちゅ）ら海水族館の黒潮水槽の全景図
成長すると全長１０ｍを越すジンベエザメ３尾が泳ぎ、幅３５ｍ・奥行き２７ｍ・深さ１０ｍで７，５００ｍ３の容積を持つ巨大水槽。
＜用語解説＞
- 注１） ＤＮＡの塩基配列
- ＤＮＡはデオキシリボ核酸の略で遺伝子の本体となる物質。４種類の塩基（アデニン・シトシン・グアニン・チミン）が鎖のように連なり遺伝情報を蓄積する。その連なりを塩基配列と呼ぶ。
- 注２） 次世代シーケンサー
- 数十万から数千万本のＤＮＡの塩基配列を同時に短時間で決定できる最新の分析機器の総称。従来のサンガー法と比べて数千から数万倍の分析能力を持つ。次世代シーケンサーを使うことでヒトゲノムがわずか千ドルで分析できるようになった。
- 注３） ミトコンドリアゲノム
- ミトコンドリアは細胞内小器官といって、呼吸からエネルギーを取り出す際に重要な役割を果たす器官。核とは別の独自のゲノム（遺伝子の総体）を持つことが知られており、コピー数が多いなど実験上扱いやすいために、生物多様性研究のさまざまな分野に用いられる。全長がわずか１６，５００塩基対ほどの環状ゲノム。ヒトの場合、核ゲノムは３０億塩基対もある。
- 注４） プライマー
- ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられる一本鎖ＤＮＡのこと。ＰＣＲで増幅したいＤＮＡ（テンプレート）の両脇に設計され、それらがテンプレートと結合することにより、そこを起点とした合成反応が始まる。
- 注５） ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
- 微量のＤＮＡ断片を増幅する技術の１つ。①二本鎖ＤＮＡの変性（９４℃）、②一本鎖ＤＮＡへのプライマーの結合（５０～６５℃）、③テンプレートＤＮＡの合成（７２℃）の３つのステップを２５～３５回繰り返すことで，微量のＤＮＡ断片を増幅する。増幅にあたっては①のＤＮＡの変性のステップでも失活しない耐熱性酵素を用いる。
- 注６） 魚類３０，０００種の多様性を代表する９６種
- 魚類の代表的なグループである無顎類（むがくるい：ヤツメウナギ・ヌタウナギの仲間で約１００種）、軟骨魚類（ギンザメ・サメ・エイの仲間で約１，０００種）、条鰭類（じょうきるい：コイ、クロマグロ、マダイなどの魚類の大半を占めるグループで約３０，０００種）、肉鰭類（にくきるい：シーラカンスやハイギョの仲間で約１０種）全てを含む９６種類。
＜論文タイトル＞
“MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species”
（魚類環境ＤＮＡメタバーコーディング用ユニバーサルプライマーＭｉＦｉｓｈ：亜熱帯産魚類を２３０種以上検出）
doi ：10.1098/rsos.150088
＜お問い合わせ先＞
＜研究に関すること＞
宮 正樹（ミヤ マサキ）
千葉県立中央博物館 主席研究員／動物学研究科長
〒260-8682 千葉県千葉市中央区青葉町９５５－２
Tel：043-265-3274 Fax：043-266-2481
E-mail：
源 利文（ミナモト トシフミ）
神戸大学 大学院人間発達環境学研究科 特命助教
〒657-8501 兵庫県神戸市灘区鶴甲３－１１
Tel／Fax：078-803-7743
E-mail：
岩崎 渉（イワサキ ワタル）
東京大学 大学院理学系研究科 准教授
〒113-0032 東京都文京区弥生２－１１－１６
Tel：03-5841-3047 Fax：03-5841-4691
E-mail：
荒木 仁志（アラキ ヒトシ）
北海道大学 大学院農学研究院 教授
〒060-8589 北海道札幌市北区北９条西９丁目
Tel／Fax：011-706-3893
E-mail：
＜ＪＳＴ事業に関すること＞
川口 哲（カワグチ テツ）
科学技術振興機構 戦略研究推進部
〒102-0076 東京都千代田区五番町７ Ｋ’ｓ五番町
Tel：03-3512-3524 Fax：03-3222-2066
E-mail：
＜報道担当＞
科学技術振興機構 広報課
〒102-8666 東京都千代田区四番町５番地３
Tel：03-5214-8404 Fax：03-5214-8432
E-mail：
千葉県立中央博物館 企画調整課
〒260-8682 千葉県千葉市中央区青葉町９５５－２
Tel：043-265-3494 Fax：043-266-2481
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神戸大学 総務部 広報課
〒657-8501 兵庫県神戸市灘区六甲台町１－１
Tel：078-803-5083 Fax：078-803-5088
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東京大学 理学部 広報室
〒113-0033 東京都文京区本郷７－３－１
Tel：03-5841-8856
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＜水族館映像資料に関すること＞
上間 智恵（ウエマ チエ）、又吉 健太郎（マタヨシ ケンタロウ）
一般財団法人 沖縄美ら島財団 経営企画部 経営企画課 広報ＩＴ係
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