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平成２７年３月１２日

京都大学 ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）
科学技術振興機構（ＪＳＴ）

ＦＯＰ患者さん由来ｉＰＳ細胞を用いて、病態再現と創薬に向けた評価系の構築に成功

ポイント

松本 佳久　大学院生（京都大学 ＣｉＲＡ／再生医科学研究所／名古屋市立大学 大学院）、池谷 真　准教授（京都大学 ＣｉＲＡ）、戸口田 淳也　教授（京都大学 ＣｉＲＡ／再生医科学研究所／医学研究科）らの研究グループは、患者さん由来の疾患ｉＰＳ細胞より、患者さんの遺伝情報をもつ対照ｉＰＳ細胞を作製し、それぞれから軟骨細胞を誘導し、ＦＯＰの病態の再現やメカニズムの一端を明らかにしました。

具体的には、まず、ＦＯＰ患者さん由来の疾患ｉＰＳ細胞において、ＦＯＰの原因となる遺伝子変異を野生型に修復しました。これにより、修復した変異以外はもとの患者さんと同じ遺伝情報をもつ対照ｉＰＳ細胞を作製することに成功しました。患者さん由来の疾患ｉＰＳ細胞と対照ｉＰＳ細胞を軟骨細胞へと分化させたところ、疾患ｉＰＳ細胞では軟骨への分化能が亢進していることを確認しました。また、双方のｉＰＳ細胞から軟骨へと分化させる途中の段階（間葉系間質細胞）で様々な遺伝子の発現を調べたところ、ＭＭＰ１とＰＡＩ１という２つの遺伝子が疾患ｉＰＳ細胞で発現が亢進しており、ＦＯＰの病態に寄与していることが示唆されました。

今回の研究でのアプローチのように、ＦＯＰの変異以外は同じ遺伝情報をもつ細胞を対照細胞とし、比較することで、原因変異によるメカニズムに、より焦点をあてて調べることができます。そのため、より的確な病気のメカニズムの検討、より効率的で有効な創薬につながると期待されます。

この研究成果は２０１５年３月１２日午前９時（米国東部時間）に「Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ」で公開されます。

＜研究の背景＞

ＦＯＰは筋肉や腱、靭帯などの軟部組織の中に、徐々に骨ができてしまう（異所性骨化）病気で、２００万人に１人程度の割合で患者さんがいると言われている希少難病の１つです。これまでの研究により、ＡＣＶＲ１と呼ばれる遺伝子に変異が生じて、その遺伝子が過剰に働くとＦＯＰとなることが分かっていました。しかし、ＦＯＰ患者さんの体内から組織サンプルを採取すると骨化を促進し病状を悪化してしまうことや、マウスを使ったＦＯＰ病態モデル注１）の限界から、ＦＯＰ発症の詳細なメカニズムについては不明な点が多いとされてきました。

これまでにグループは、ｉＰＳ細胞から軟骨への分化誘導法を確立し、異所性骨化の重要な過程の１つと考えられている軟骨への分化能について検討を行っています。しかし、これまでは病気のメカニズムを調べるために、患者さん由来のｉＰＳ細胞とＦＯＰではない人由来のｉＰＳ細胞からそれぞれ分化した細胞を比較しており、両者の遺伝的背景が異なっていました。そのため、両者の比較からは、病態に無関係な遺伝情報の個人差が病気の原因として検出される可能性がありました。

そこで本研究では、ＦＯＰを引き起こす変異以外は同じ遺伝情報をもつ対照ｉＰＳ細胞を作製し、それと疾患ｉＰＳ細胞の軟骨への分化能を比較することにより、ＦＯＰのメカニズムの一端の解明を試みました。

なお、本研究については、２０１１年から大日本住友製薬株式会社と共同研究を行っています。

＜研究結果＞

１．患者さん由来疾患ｉＰＳ細胞から対照ｉＰＳ細胞の作製

まず、ＦＯＰ患者さんから作製した疾患ｉＰＳ細胞（ＦＯＰ－ｉＰＳＣ。以降、本文章中では患者さん由来の疾患モデル細胞をＦＯＰにて表す）のゲノム中の原因変異（ＡＣＶＲ１遺伝子の７番目のエクソン注２）にある変異）をＢＡＣ（大腸菌人工染色体）注３）ベクターを用いた相同組換え注４）により、野生型に修復しました（遺伝子修復）。その結果、変異の修復されたｉＰＳ細胞株（ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣ。以降、本研究で作製した患者さん由来の対照細胞をｒｅｓＦＯＰにて表す）を作製することに成功しました。このｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣは、修復した変異以外は、もとの患者さん由来ｉＰＳ細胞と、同じ遺伝情報をもっているため、ＦＯＰ変異やそれに関連する病気のメカニズムを調べる上で、より厳密な対照細胞となります。

なお、ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣでは、多能性を示すマーカーが発現しており、またテラトーマ（奇形腫）注５）を形成することから多能性を持つことが確認されました。ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣの形や増殖能、テラトーマ内の軟骨組織部分は、もとのＦＯＰ－ｉＰＳＣと同様でした。

２．ＦＯＰ－ｉＰＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣの、軟骨分化能の確認と病態再現

次に、ＦＯＰ－ｉＰＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣそれぞれから神経堤細胞（ＮＣＣ）注６）、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）注７）を介して、マイクロマス培養法注８）により軟骨へと分化誘導しました。ＭＳＣの段階から誘導１０日後の軟骨組織を観察したところ、ＦＯＰ－ｉＰＳＣ由来の軟骨では、ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣ由来の軟骨よりも軟骨のマーカー遺伝子（ＳＯＸ９，ＣＯＬ２Ａ１，ＡＣＡＮ）が高く発現しており、より大きな軟骨組織が形成されました。このことは、ＦＯＰ患者さんの軟骨ができやすいという病態の一部を培養皿の上で再現することができたと考えられます。また、これにより、ＦＯＰ患者さん体内に存在する変異ＡＣＶＲ１が軟骨への分化と成熟を促進していることが確認されました。

３．網羅的遺伝子解析による発現量の違う遺伝子群の同定

また、ｉＰＳ細胞、ＮＣＣ、ＭＳＣそれぞれの段階で、マイクロアレイ注９）を用いて、様々な遺伝子の発現を調べ、比較しました。それぞれの段階において、患者さん由来の疾患細胞と対照細胞はまとまって、標準的な細胞と異なる群に分類されています。これは遺伝子発現パターンが極めて近いことを示し、遺伝的背景がほぼ同一な細胞であることに一致した結果であると考えられます。

また、ＦＯＰ－ｉＰＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣ、また途中の段階のＦＯＰ－ｉＮＣＣ（ＦＯＰ－ｉＰＳＣ由来ＮＣＣ）とｒｅｓＦＯＰ－ｉＮＣＣ（ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣ由来ＮＣＣ）では遺伝子の発現にほとんど違いが見られませんでした。ところが、ＭＳＣの段階では、ＦＯＰ－ｉＭＳＣでｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣに比べ１９１もの遺伝子が２倍以上高く発現し、１１０遺伝子が２倍以上発現が低いことが確認されました。これにより、ＦＯＰ細胞とｒｅｓＦＯＰ細胞は、ＭＳＣの段階でいくつか異なる遺伝子発現が見られるようになることが分かりました。中でもＭＭＰ１遺伝子とＰＡＩ１遺伝子がとりわけＦＯＰ－ｉＭＳＣで高く発現していました。また、これらの遺伝子には軟骨分化を促進する働きがあり、ＦＯＰの病態に寄与していることが分かりました。

＜まとめ＞

本研究では、ＦＯＰ患者さん由来疾患ｉＰＳ細胞のＦＯＰ変異を修復することで、ＦＯＰ変異以外の遺伝的背景が同一の患者さん由来対照ｉＰＳ細胞を作製することに成功しました。疾患ｉＰＳ細胞と対照ｉＰＳ細胞を軟骨へと分化誘導させることで、疾患ｉＰＳ細胞からは軟骨ができやすいという病態を体外で再現できました。また疾患モデル細胞と対照細胞を比較すると、とりわけ２つの遺伝子が疾患モデル細胞で発現が高く、また、軟骨生成を促し、ＦＯＰの病態に関与することが分かりました。

今回のような患者さん由来の対照ｉＰＳ細胞の作製はＦＯＰ以外の疾患においても、より的確な病態メカニズムの解明や有効な創薬へとつながると期待されます。

＜論文名と著者＞

論文名 “New protocol to optimize iPS cells for genome analysis of fibrodysplasia ossificans progressiva”
ジャーナル名 Stem Cells
著者 Yoshihisa Matsumoto1,2,3,†, Makoto Ikeya2,†,*, Kyosuke Hino2,4, Kazuhiko Horigome2,4, Makoto Fukuta1,2,3, Makoto Watanabe2,5, Sanae Nagata2, Takuya Yamamoto2,6, Takanobu Otsuka3, and Junya Toguchida1,2,7,*
† 筆頭著者　＊ 責任著者
著者の所属機関
  • １．京都大学 再生医科学研究所
  • ２．京都大学 ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）
  • ３．名古屋市立大学 大学院医学研究科
  • ４．大日本住友製薬株式会社 研究本部先端創薬研究所
  • ５．島津製作所 基盤技術研究所
  • ６．京都大学 物質－細胞統合システム拠点（ｉＣｅＭＳ）
  • ７．京都大学 大学院医学研究科

＜本研究への支援＞

本研究は、下記機関より資金的支援を受けて実施されました。

＜参考図＞

図１　ＦＯＰ患者さん由来ｉＰＳ細胞（ＦＯＰ－ｉＰＳＣ；左）と遺伝子修復したｉＰＳ細胞（ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣ；中・右）

スケールバー：２００μｍ

図２　ＦＯＰ－ｉＭＳＣ（ＦＯＰ－ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ）とｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣ（ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ）
から分化誘導した軟骨組織（それぞれ、左、中・右）

ＦＯＰ－ｉＭＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣから分化誘導１０日目の軟骨組織の様子を示している。
軟骨組織の軟骨基質がアルシアン青染色にて青く染められている。
ＦＯＰ－ｉＭＳＣからはｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣからよりも大きな軟骨組織が形成された。

図３　それぞれの細胞の遺伝子発現の近似性

マイクロアレイで遺伝子の発現を調べ、各細胞の遺伝子発現の近似性を調べた。
下のヒートマップでは紫色が発現の高い遺伝子、緑色が発現の低い遺伝子を示している。
また、上の樹形図では、低い位置で枝分かれしているほど遺伝子発現パターンが近いことを示している。
これらよりＦＯＰ細胞は標準細胞よりも、ｒｅｓＦＯＰ細胞に近似していることが分かる。

ＰＳＣ、ｉＮＣＣ、ｉＭＳＣ：標準的なｉＰＳ細胞、それから分化した神経堤細胞、間葉系間質細胞

図４　ＦＯＰ－ｉＭＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣでの遺伝子発現の違い

赤い棒グラフはＦＯＰ－ｉＭＳＣでｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣよりも発現が高い遺伝子、青い棒グラフはｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣでＦＯＰ－ｉＭＳＣよりも発現が高い遺伝子を示している。
横軸の数字は、遺伝子発現量の違いを倍数で示したもの。

図５　今回の研究のまとめ

＜用語解説＞

注１） 病態モデル
その病気に特徴的な症状や性質を再現したもの。研究を行う際には、病態モデルを用いて病気の原因究明を行う。これまでも病態を再現した実験動物が、病態モデルとして多くの基礎研究に利用されていた。しかし、ヒトと実験動物とではシステムが異なることもあり、有効な病態モデルが得られないこともあった。ヒトの疾患特異的ｉＰＳ細胞から病態が再現できれば、病態解明、創薬を目指した研究が進めやすくなると期待されている。
注２） エクソン
遺伝子を構成するＤＮＡのうち、転写後、最終的にｍＲＮＡとなる部分。ｍＲＮＡはリボソームにおいて翻訳されタンパク質を形成する。
注３） ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：大腸菌人工染色体）
約３００ｋｂまでの長い遺伝子をクローニングできる、大腸菌が宿主のベクター（運び屋）である。大腸菌内での相同組換えにより、容易に遺伝子を任意に導入できる。
注４） 相同組換え
ＤＮＡの塩基配列がよく似た領域（相同部位）で起こるＤＮＡの組換えのこと。二本鎖のＤＮＡには、切断や変異が起こっても相補鎖を元に修復する機能が備わっており、これらの性質を応用して目的の場所の遺伝情報を変える技術。
注５） テラトーマ（奇形腫）
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞を免疫不全マウスの皮下などに注射すると、腫瘍を形成する。この腫瘍はテラトーマと呼ばれ、様々な種類の組織が混在している。テラトーマを観察し、様々な組織に分化していることを確認することは、細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の１つである。
注６） 神経堤細胞（ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ　ｃｅｌｌ：ＮＣＣ）
頭頚部骨格系、角膜、末梢神経系、皮膚色素細胞など多様な細胞種への分化能を有する、胎児期に一過的に現れる移動性の細胞集団。神経冠細胞と呼ばれることもある。
注７） 間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）
骨・軟骨・脂肪細胞などといった間葉系の細胞に分化する能力を持った間質（結合組織）の細胞。軟骨への分化過程の１つに、神経堤細胞から間葉系間質細胞を経由して分化する過程が知られている。
注８） マイクロマス培養法
細胞を高濃度で調製し、滴状で培養皿上に播種することで作製される高密度の細胞塊をマイクロマスと呼び、その状態で培養する方法をマイクロマス培養法と呼ぶ。軟骨分化の際に用いられる。
注９） マイクロアレイ
多種類の微量な分子（核酸や抗体など）を基盤上に固定し、それに解析対象とするサンプルを作用させることで、一度に膨大な数のＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質の質や量を網羅的に検査することができる解析技術。

＜お問い合わせ先＞

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京都大学 iPS細胞研究所(CiRA) 研究支援部門 国際広報室
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〒606-8507　京都市左京区聖護院川原町53
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