細胞に「食べる」機能を付与
～細胞に新機能を付与する新しい研究ツール～

ポイント

• 貪食細胞が体内の異物を「食べ」て除去する現象の分子機序の詳細は明らかとなっていない。
• 特定たんぱく質の細胞表面の局在を分単位で発現・制御できるＤＩＳｐｌａｙ法を開発し、「食べる」活性の低い細胞に「食べ」させることに成功。
• 本手法は、複雑な分子経路によって制御されるさまざまな生命現象の研究に応用できる。

＜研究の背景と経緯＞

細胞は、多数のシグナル分子が複雑なシステムを形成し、恒常性を維持しています。例えば、不要になった細胞は、貪食細胞と呼ばれる細胞のファゴサイトーシスという現象によって「食べ」られ、貪食細胞内で消化、除去されます。こうした動的なシステムの成り立ちを理解する目的で、細胞内の構成因子の働きに積極的な変動（摂動）を加え、その応答を調べる研究手法が広く用いられています。遺伝子発現、ノックダウンといった転写レベルで標的たんぱく質のレベルを制御する手法は最も有用なものですが、その摂動にかかる時間が非常に長いことが、秒、分、時間のオーダーでダイナミックに制御される生命現象の理解を目指す目的に不適であるという場面がしばしば訪れます（図１Ａ）。これに対し、有機小分子を用いてたんぱく質を迅速に結合させることによって、より速い時間スケールでの摂動を可能とする実験系が近年相次いで開発され、非常に有用な研究ツールとして発展を遂げています（参考文献１）。この代表的なものは、ＦＫＢＰ、ＦＲＢという２つのたんぱく質の相互作用を利用したツールです。ＦＫＢＰ、ＦＲＢは、有機小分子ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の添加によって結合する性質を持っています。このような実験系に基づいて、これまでに「細胞内部」の重要な生命現象を速い時間スケールで制御する実験系の開発が精力的に行われてきました。その一方で「細胞表面」の情報伝達を速い時間スケールで制御する実験系というのは、これまでにほとんど開発が行われておらず（参考文献２）、有用な手法の確立が強く望まれていました。

＜研究の内容＞

細胞表面は、シグナル伝達の授受の場であり、また、細胞がほかの細胞や細胞外基質と相互作用する場であることから、細胞の恒常性の維持に非常に重要な役割を果たしています。そこで、競合の実験系に比べ反応速度の点で優位性を持つＦＲＢ－ＦＫＢＰ系をカスタマイズして、細胞外環境と細胞表面の細胞外の生命現象に摂動を加える実験系の開発に着手しました。カスタマイズにあたっての難しさは、細胞膜を透過して細胞の外側に機能性たんぱく質を露出させることが必要である、という点に集約されます（図１Ｂ）。そこで、井上准教授らは、目的とする機能性たんぱく質を、細胞内小器官であるゴルジ体^注２）の膜上に集積させておき、任意のタイミングで細胞膜に輸送されるたんぱく質と結合させることで、細胞膜外に発現させる実験系を構築することを目指しました。

井上准教授らは、ゴルジ体に留まるたんぱく質（滞在型たんぱく質）と、細胞外膜に輸送されるたんぱく質（輸送型たんぱく質）を結合させれば、滞在たんぱく質も細胞外膜に輸送されるようになるのではないかと考えました（図１Ｃ）。そこで、効率的に細胞膜に輸送される組み合わせを探し出すため、滞在型と輸送型のさまざまなたんぱく質をＦＫＢＰやＦＲＢに結合したキメラたんぱく質の組み合わせを全６種類作製し、その全ての組み合わせの輸送効率を試しました。その結果、Ｇｉａｎｔｉｎ（ジャイアンティン）のゴルジ体膜貫通部位とＫ－Ｒａｓ（Ｋ－ラス）の細胞膜標的配列の組み合わせであれば輸送効率が高いことを見いだしました（表１）。膜輸送を利用するという性質上、この局在の変化を伴う摂動系は１５分～４５分という時間を要しますが、現在ある細胞表面提示の摂動系としては最も速いものです。井上准教授らはこの手法をＤＩＳｐｌａｙ（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｄｉｓｐｌａｙ）と名づけました。

続いてＤＩＳｐｌａｙ法をファゴサイトーシスに応用し、本来はファゴサイトーシスが得意でない細胞の表面に必要最小限の関連分子を発現させ、ファゴサイトーシスを誘導できるかを確かめました。具体的には、死細胞の表面にのみ発現する特定の膜脂質を認識して結合する、ＭＦＧ－Ｅ８^注３）たんぱく質の一部分（Ｃ２ドメイン^注４））を、ＨｅＬａ細胞やＣＯＳ－７細胞（どちらも本来はファゴサイトーシスが得意でない）の細胞膜表面に、ＤＩＳｐｌａｙ法を用いて提示する仕組みを構築しました。この細胞はラパマイシンの添加後１時間以内に、標的となる死細胞と接着することが分かりました。しかし、死細胞をファゴサイトーシスするには至りませんでした（図２）。

先行研究（Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．１１３，２９５５（２０００））から細胞表面に小さなビーズを付着させておいて、細胞内にあるＲａｃ１^注５）たんぱく質を活性化させると細胞がビーズを「食べる」ことが分かっていました。ファゴサイトーシスでは、死細胞を取込むため細胞の形状を大きく変える必要がありますが、Ｒａｃ１たんぱく質は細胞骨格^注６）であるアクチンの再編成を促します。そこでＤＩＳｐｌａｙ法を適用した細胞内で、Ｒａｃ１を活性化させることとしました。すると、Ｃ２ドメインが細胞表面にあり、かつＲａｃ１が活性化した細胞は、死細胞を細胞内に取り込んでおり、ファゴサイトーシス現象が起こることが分かりました。

＜今後の展開＞

今回の研究で、死細胞との接着およびＲａｃ１による細胞骨格の活性化という２つの刺激のみによって、ファゴサイトーシス活性の低い細胞であっても、ファゴサイトーシスを開始させることができると分かりました（図３、図４）。これは、複雑なファゴサイトーシス過程の分子経路を解明するうえで重要な示唆を与えるものです。

また、「ＤＩＳｐｌａｙ」法は、有機小分子の添加によって細胞現象を任意のタイミングで、分単位で発現制御できるツールです。ファゴサイトーシスだけではなく、細胞同士の相互作用が鍵となるさまざまな生命現象（例えば受精、神経網形成、血管形成、創傷治癒、免疫反応）についての研究にも応用でき、複雑な分子経路の解明や制御を行う際に大いに役立つものと考えられます。

細胞の機能を改変することにより、生命現象の成り立ちを明らかにし、これを基礎研究、医療に役立てることを目指す合成生物学研究の重要性が、強く提唱されています。特に、海外の先端的な研究では、これに基づいて創り出される「人工細胞」の医療への応用可能性を示す研究成果が多数報告されてきており、その実現可能性が議論される段階となっています（参考文献３）。「ＤＩＳｐｌａｙ」法は、細胞に付与した新しい機能を分単位で発現させることを可能とする点で非常に画期的といえます（参考文献４）。今後の展開としては、ＤＩＳｐｌａｙ法をさらに改良することでファゴサイトーシスの効率と精度を高めること、またそうした次世代型ＤＩＳｐｌａｙ法を適用することで、将来的にがん細胞などの病原細胞を生体内でファゴサイトーシスできるような人工細胞を作製し治療に応用することが挙げられます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） ファゴサイトーシス

外部から侵入した異物や生体内の死細胞などを細胞内に取込む仕組みのこと。免疫担当細胞であるマクロファージなど一部の細胞のみが行う。マクロファージのファゴサイトーシス開始過程においては、細胞表面に発現する膜たんぱく質（ＭＦＧ　Ｅ－８やＴｉｍ４やＧａｓ６）を通して標的となる死細胞へ結合し、インテグリン受容体下流のエフェクターの活性化が起こるなど、非常にたくさんの分子が相互作用している（参考文献５）。

注２） ゴルジ体

細胞の郵便局。小胞体で作られたたんぱく質を標的配列（住所）に応じて仕分けする。

注３） ＭＦＧ－Ｅ８

マクロファージの表面に発現しているインテグリン受容体と死細胞表面にのみ発現している標識の２つに同時に結合するたんぱく質。生体内で起こる効率的なファゴサイトーシスに必要不可欠。

注４） Ｃ２ドメイン

ＭＦＧ―Ｅ８の一部分で死細胞表面にのみ発現している標識（フォスファチジルセリン）に結合する。

注５） Ｒａｃ１

低分子量Ｇたんぱく質でアクチンを基礎とする細胞骨格の再編成を行う。一般的に細胞の運動性を司る。

注６） 細胞骨格

細胞の屋台骨の役割をになう構造。代表的なものがアクチン、微小管、中間径フィラメントの３種類で、細胞の形や運動性を制御している。

＜論文タイトル＞

“Rapidly rendering cells phagocytic through a cell-surface display technique and concurrent Rac activation”
（ディスプレイ法とＲａｃ活性化により細胞に食べる機能を付与）
doi: 10.1126/scisignal.2005123

＜参考文献＞

１．研究代表者が主著者となっている代表的な研究成果として、Ｎａｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓ ２、４１５－４１８（２００５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４，１４５４－１４５７（２００６）、Ｎａｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓ ７，２０６－２０８（２０１０）などが挙げられる。

２．細胞表面の制御に関する先行研究は主に２つ。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，２００７（２０００）では、生きた細胞の表面をシュタウディンガー反応という有機化学処理により、有機小分子で修飾した例がある。しかしこの手法は有機小分子への適用に限定され、また３日間というとても長い反応時間が必要。２例目はＪ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２０１，６３１（２０１３）で、光照射を刺激として、細胞の小胞体からゴルジ体を経て細胞膜表面にたんぱく質を輸送する手法が報告されている。この手法の限界は、３１２ナノメートルとかなり毒性の強いＵＶ光をあてること、また時間が２－３時間かかること、そして比較的新しい研究のため、まだ応用例がないことが挙げられる。

３．関係する研究例としては、Ｎａｔｕｒｅ ４８８、３８４－（２０１２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２、１５６５－１５６８（２０１１）などが挙げられ、関連するレビューとしてはＳｃｉ.Ｔｒａｎｓ.Ｍｅｄ. ５、１７９－、（２０１３）などが挙げられる。

４．ＤＩＳｐｌａｙ法のより詳しい説明は、「生体の科学」（医学書院）の特集「生命動態システム科学」の記事で紹介予定。

５．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）１６，１８９

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ジョンズホプキンス大学 医学系研究科　准教授
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小松 徹（コマツ トオル）
東京大学 大学院薬学系研究科　特任助教
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