ポイント
- 既存アルツハイマー病モデルマウスに比べヒト患者により近い病理を再現。
- 既存のモデルマウスで得られたこれまでの結果の一部は見直しの必要がある。
- アルツハイマー病の基礎・応用研究のための新たな世界標準のツールに。
理化学研究所（理研、野依 良治 理事長）は、既存のアルツハイマー病モデルマウスよりも、アルツハイマー病患者脳内のアミロイドの蓄積を忠実に表わす、次世代型アルツハイマー病モデルマウスの開発に成功しました。これは、理研 脳科学総合研究センター（利根川 進 センター長）神経蛋白制御研究チームの西道 隆臣 シニアチームリーダー、斉藤 貴志 副チームリーダーらによる成果です。
疾患研究には、病態を忠実に再現するモデル動物が不可欠です。モデル動物の作製では、通常、病気の原因となる遺伝子を同定し、その遺伝子を過剰に発現させるか、欠損させます。アルツハイマー病では、アミロイドβペプチド（Ａβ）注１）が凝集し、アミロイド斑となって脳内に過剰に蓄積することが病気の発症の引き金と考えられており、これまでにＡβの前駆体であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）注２）の遺伝子変異が同定されています。そのため、ＡＰＰを非生理的に過剰に発現させたＡＰＰ過剰発現マウスが、第一世代アルツハイマー病モデルマウスとして主に使用されてきました。しかし、過剰発現したＡＰＰの記憶障害などの非生理的な効果が強く、また脳内のアミロイドの蓄積もアルツハイマー病患者との類似性が乏しいため、ヒトのアルツハイマー病のモデルとして適切だとは言い切れませんでした。
研究グループは、この問題を解決するため、遺伝子の過剰発現法を用いずに、患者でみられる遺伝子変異と正常な遺伝子を“置き換える”方法（ノックイン技法注３））により「ＡＰＰノックインマウス」の開発に成功し、解析を行ってきました。ＡＰＰノックインマウスは、患者の脳におけるアミロイドの蓄積に忠実なだけでなく、既存モデルでしばしば発生する研究途中での突然死が起きないため、アルツハイマー病モデルとして極めて有用なモデルです。今回、開発に成功したモデルマウスは、既存のモデルに替わる世界標準となる可能性が高く、未解明のアルツハイマー病の病態メカニズムの解明から、予防・治療のための創薬や診断法の開発など、臨床応用のための研究に資する重要な研究ツールやリソース基盤になると期待できます。
本研究成果は、科学技術振興機構（ＪＳＴ） 戦略的創造研究推進事業および文部科学省分子イメージング研究戦略推進プログラムの一環として行われ、米国の科学雑誌『Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ』５月号に掲載されるに先立ち、オンライン版（４月１３日付け：日本時間４月１４日）に掲載されます。
＜背景＞
アルツハイマー病は、脳内にアミロイドβペプチド（Ａβ）が凝集し、アミロイド斑となって過剰に蓄積することが、発症の引き金と考えられており、アミロイド斑の形成（アミロイドの蓄積）に伴う慢性炎症病態の誘導、シナプス機能の低下などを示し、最終的には神経変性・神経細胞死に至るとされています。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から酵素による切断を受け生理的に産生されます。家族性（遺伝性）アルツハイマー病の場合、これまでに多くのＡＰＰの遺伝子変異が同定されており、その遺伝子変異の効果によりＡβの産生が加速していることが明らかとなっています。
１９９５年、アルツハイマー病のモデルマウスとして、ＡＰＰ遺伝子を外部から追加挿入する「過剰発現法」を用いてＡＰＰを過剰に発現させたＡＰＰトランスジェニックマウス（ＡＰＰ過剰発現マウス）が作製されました。以来、ＡＰＰ過剰発現マウスが、研究ツールとして一般的に利用されてきました。しかし、ＡＰＰ過剰発現マウスは、ＡＰＰを過剰に発現させたことによる記憶障害などの非生理的な効果が強く（図１）、アミロイド斑の形成状態もヒトのアルツハイマー病患者との類似性が乏しいため（図２）、ヒトのアルツハイマー病のモデルマウスとして適切であるとは言い切れません。また、飼育・繁殖中にしばしば原因不明の突然死を起こし、アミロイド斑形成も個体差が大きいため、モデルマウスとして問題がありました。そのため、より患者に近似したモデル動物の開発は、重要な課題となっていました。
＜研究手法と成果＞
研究チームは、ＡＰＰの過剰発現法ではなく、遺伝子を置き換える「ノックイン技法」を用いてモデルマウスの開発を試みました。具体的には、家族性アルツハイマー病の遺伝子変異注４）（Ａβ産生量を増加させるＳｗｅｄｉｓｈ変異とＡβの一種であるＡβｘ－４２の産生比率を増加させるＩｂｅｒｉａｎ変異、およびマウスＡβが凝集性を示さないため、Ａβの配列をヒト化させＡβを凝集させるなど）を多重に、同時に組み込んだターゲッティングベクター注５）を作製し、ノックインによる遺伝子の置き換えを行うことで、「第二世代ＡＰＰマウス」の創出に成功しました（図３）。ＡＰＰ過剰発現マウスは、１２カ月齢からアミロイド斑の形成が認められますが、ＡＰＰを過剰発現させていない第二世代ＡＰＰマウスでは、ＡＰＰの発現量は野生型と同等であるにも関わらず、アミロイド斑の形成は６カ月齢から確認されました。さらに、第二世代ＡＰＰマウス脳内では、加齢を重ねるほどアミロイド斑が形成され、蓄積するＡβ種も患者と同様でした（図４Ａ）。また、アミロイド斑の形成に伴い、神経炎症（図４Ｂ）やシナプスの脱落も認められ、１８カ月齢から記憶学習能の低下が認められました（図４Ｃ）。
次に、第二世代ＡＰＰマウスの応用性を確認するため、他の遺伝子改変マウスとの交配実験を行いました。一例として、タンパク質分解酵素・カルパイン（細胞内システインプロテアーゼ）の内因性阻害物質注６）・カルパスタチンを欠損させたマウス（Ｃａｓｔ－ＫＯ）との交配を行いました。以前、研究チームは患者のアミロイド斑の形成部位周辺でカルパインが活性化していることを見いだし、カルパインがアルツハイマー病の病理に何らかの影響を及ぼしている可能性を示しました。その際に、ＡＰＰ過剰発現マウスとＣａｓｔ－ＫＯマウスの交配を行いましたが、その交配仔は１０週齢までに半数以上が死亡するという原因不明の短命化を引き起こしました。しかし、第二世代ＡＰＰマウスとＣａｓｔ－ＫＯマウスの交配仔（カルパスタチン欠損第二世代ＡＰＰマウス）は、短命化を引き起こしませんでした（図５）。このことは、本来はＡＰＰに変異があるマウスとＣａｓｔ－ＫＯマウスを交配しても、その交配仔は短命化を起こさないはずが、ＡＰＰ過剰発現マウスはＣａｓｔ－ＫＯと交配することで交配仔の個体死を誘導するという、非常に人工的なモデルであったことが改めて明らかとなりました。
続いて、カルパスタチン欠損第二世代ＡＰＰマウスの経時解析を行いました。その結果、同月齢の第二世代ＡＰＰマウスに比べてアミロイド斑の形成時期が早いこと、神経炎症が加速し記憶学習能の低下時期が早まり病態が悪化することが明らかとなりました。このように、第二世代ＡＰＰマウスと他の遺伝子改変マウスの交配仔の解析を行うことで、アミロイド斑の増悪因子や改善因子を見いだすことが可能となります。
さらに研究グループは、第二世代ＡＰＰマウスに、家族性アルツハイマー病変異の１つでありＡβが蓄積しやすくなるＡｒｃｔｉｃ変異を組み込んだ第三世代ＡＰＰマウスの創出にも成功しました。その結果、この第三世代ＡＰＰマウスは、２カ月齢からアミロイド斑の形成を示し、１８カ月齢の第二世代ＡＰＰマウスよりも激しい神経炎症を示しました（図６）。記憶学習能の低下も６カ月齢から認められ、第三世代ＡＰＰマウスは、研究時間を短縮させることができます。これにより、アミロイド斑の形成初期を標的とした実験には第二世代ＡＰＰマウスを、アミロイド斑形成後の脳内病態変化を標的とした実験には第三世代ＡＰＰマウスを、などという形で実験目的によって、第二世代、第三世代ＡＰＰマウスを使い分けることも可能になります。
＜今後の期待＞
これまでのアルツハイマー病の研究では、ＡＰＰ過剰発現マウスのように非常に人工的なモデルマウスを使用して、病態の解析が進められてきた背景があるため、基礎研究から創薬などの応用研究において、正しい研究や薬物候補の評価がなされてきたのか不確定な面があります。今回開発した第二世代や第三世代ＡＰＰマウスを用いて研究を進めていくことで、今後、従来のＡＰＰ過剰発現マウスにより得られた結果を一部見直す必要性が生じる可能性があるかもしれません。それ以上に、いまだに解明されていないアルツハイマー病の慢性の炎症性病態の分子メカニズムの解明に向けた基礎研究を推し進めることが可能になり、アルツハイマー病の予防・治療のための創薬研究のみならず、早期診断法開発などの臨床応用のための研究に資する、新たな世界基準となる重要な研究ツールとして大きく寄与すると期待できます。
＜参考図＞
図１ 第一世代：ＡＰＰ過剰発現マウスの問題点
ＡＰＰ過剰発現マウスは、野生型マウスに対して約１０倍のＡＰＰを非生理的に発現している。Ａβは、酵素の作用により、ＡＰＰの①β切断部位次いで②γ切断部位の順に切断を受け産生されるが、Ａβ以外の断片（緑線部：ｓＡＰＰやＣＴＦ－ｂ、ＡＩＣＤ）も非生理的に産生される。これら断片には、さまざまな生理機能が報告されているため、ＡＰＰを過剰発現させることは、Ａβ以外の機能断片も過剰に産生させることになる。そのため、ＡＰＰ過剰発現マウスの表現型は、純粋にＡβの毒性によるものだけでなく、さまざまな複合効果の現れであり、アルツハイマー病のモデルマウスとして適切だとは言い切れない。
図２ アルツハイマー病患者とＡＰＰ過剰発現マウスのアミロイド斑の比較
ＡＰＰ過剰発現マウスの脳内に蓄積しているＡβの主種（Ａβｘ－４０）と患者の脳に蓄積しているＡβの種（Ａβｘ－４２）は異なるため、ヒトのアルツハイマー病のモデルとして適切だとは言い切れないことが分かる。
図３ 次世代型アルツハイマー病モデルマウス作製のためのコンセプト
Ａβは、酵素の作用により、ＡＰＰのβ切断部位次いでγ切断部位の順に切断を受け産生される。第二世代ＡＰＰマウスは、Ａβ産生量を増加させるＳｗｅｄｉｓｈ変異およびＡβｘ－４２の産生比率を増加させるＩｂｅｒｉａｎ変異を導入し、さらに、マウスのＡβ配列は凝集を示さないため、Ａβ配列のヒト化を同時に行ったマウスである。第三世代ＡＰＰマウスは、上記変異に加えて家族性アルツハイマー病の遺伝子変異の１つＡｒｃｔｉｃ変異も導入したマウスである。
図４ 第二世代ＡＰＰマウスの脳のアミロイド斑、神経炎症および学習能
- （Ａ）第二世代ＡＰＰマウスのアミロイド斑は、患者と非常に類似していた。
- （Ｂ）第二世代ＡＰＰマウスは、神経炎症（青：Ａβ、赤：ミクログリア、緑：アストロサイト）を示した。
- （Ｃ）第二世代ＡＰＰマウスは、１８カ月齢から学習能が低下していた。
図５ カルパスタチン欠損によるアルツハイマーモデルマウスの寿命の変化
ＡＰＰ過剰発現マウスは、３０週齢を過ぎた頃から原因不明の突然死を起こす。また、カルパスタチンを欠損することで、急激な短命化を引き起こすが、その原因は不明である。一方、第二世代マウスは、カルパスタチン欠損の有無にかかわらず、短命化は起こらない。すなわちＡＰＰ過剰発現マウスは非常に人工的なマウスであると言える。
Takashi Saito, Yukio Matsuba, Naomi Mihira, Jiro Takano, Per Nilsson, Shigeyoshi Itohara, Nobuhisa Iwata and Takaomi C. Saido.“Single APP knockin mouse models of Alzheimer’s disease”.Nature Neuroscience,2014,
doi: 10.1038/nn.3697
