ポイント
- 医学研究用ブタの作出は非常に煩雑で多くの時間がかかっていた。
- 人工酵素と体細胞核移植を組み合わせた効率的な方法で、免疫不全ブタを作ることに成功。
- 免疫のないブタは、ヒトの重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）注１）の疾患モデルや、新しい幹細胞治療法やがん治療法の評価・開発などへの貢献が大きく期待される。
ＪＳＴ 課題達成型基礎研究の一環として、明治大学の渡邊 將人（まさひと） 特任講師と長嶋 比呂志 教授、自治医科大学 花園 豊 教授らは、人工酵素と体細胞核移植を組み合わせた効率的な方法により、短期間（６か月）で免疫のない（免疫不全）ブタの作出に成功しました。
ブタで特定の遺伝子機能を消失させる（ノックアウト注２））には、外来遺伝子の導入を伴う相同組み換え注３））が利用されていました。しかし、この方法は手順が非常に煩雑で、目的の遺伝子で組み換えが起こる効率の低さから多くの時間を要し、またゲノムに外来遺伝子を挿入する時に、目的以外の遺伝子機能を傷つけてしまうリスクを抱えています。今後、免疫不全症などの難治性疾患や再生医療の研究に遺伝子ノックアウトブタを用いるためには、より効率的に短期間で、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクのない方法が望まれていました。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ注４）は最近発明された人工酵素で、全く新しい遺伝子編集ツールです。本研究グループは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現にＤＮＡではなくｍＲＮＡを用い、さらに体細胞核移植技術注５）を組み合わせることにより、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクなく、短期間に免疫不全ブタを作ることに成功しました。
この新手法により、今後ヒトの疾患を模倣した医学研究用ブタの作出を大きく加速できます。作製された免疫不全ブタは、ヒトＳＣＩＤ様の病態を示したことから、ヒト免疫不全症の忠実な疾患モデルとして、その治療法の研究に大きく貢献することが期待されます。また、ヒトの幹細胞やがんなどの各種評価は免疫のないマウスを用いて行われていましたが、今後はブタで可能になり、ヒトをより忠実に反映する知見が得られ、新しい幹細胞治療法やがん治療法の評価・開発につながることが期待されます。
本研究成果は、２０１３年１０月９日（米国東部時間）発行の科学誌「ＰＬＯＳ ＯＮＥ」に掲載されます。
本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。
戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）
| 研究領域 |
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）作製・制御等の医療基盤技術」
（研究総括：須田 年生 慶應義塾大学 医学部 教授） |
| 研究課題名 |
「ヒトｉＰＳ細胞の高品質化とその検証・応用」 |
| 研究代表者 |
花園 豊（自治医科大学 分子病態治療研究センター 教授） |
| 研究期間 |
平成２２年１０月～平成２８年３月 |
ＪＳＴはこの領域で、ｉＰＳ細胞を基軸とした細胞リプログラミング技術の高度化・簡便化をはじめとした研究によって、革新的医療に資する基盤技術の構築を目指している。上記研究課題では、ヒトやサルやブタのｉＰＳ細胞をより初期状態へと誘導し高品質化を図るとともに、その発生工学的応用および臨床応用を目指している。
＜研究の背景と経緯＞
ブタは解剖学的、生理学的、血液学的にヒトへの類似性が高いことから、ヒトに近い知見を得られる実験動物として利用され、実際に糖尿病やアルツハイマーなどヒトの病気を再現する病態モデルブタが作出されています。また、ヒト－ブタ間における異種移植において、臓器ドナーとして遺伝子改変ブタを利用する研究も進められています。このように利用されているブタにおいて、遺伝子改変技術の開発は非常に重要です。特定の遺伝子機能を消失させる遺伝子ノックアウト技術は、ヒトの病気を模倣した病態モデルブタの開発に極めて有用で重要です。
遺伝子ノックアウトマウスの作製では、受精卵より作出された非常に未分化で増殖性の高い胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用した相同組み換えを行い、この組み換えＥＳ細胞を初期胚に導入することでノックアウト個体の作出が行われています。しかし、ＥＳ細胞はマウスにほぼ限定的であり、ＥＳ細胞が樹立されていないブタでは、体細胞を用いて相同組み換えにより遺伝子ノックアウト細胞を取得し、これを核ドナー細胞として体細胞核移植によってノックアウト個体を作出する必要がありました。しかし、体細胞では相同組み換えが非常に低頻度でしか起こらないため、実際に個体を得るまでには多くの時間を要し、この非効率性と煩雑さが遺伝子ノックアウトブタ作出の大きな障害となっていました。
ジンクフィンガーヌクレアーゼの登場により、効率的に遺伝子改変が可能となり、研究チームはジンクフィンガーヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトがブタ初代培養細胞において可能なことを世界で初めて示しました。その後、いくつかの遺伝子ノックアウトブタが作出されていますが、これらのノックアウトブタの作出では、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現にプラスミドＤＮＡが利用されています。プラスミドＤＮＡを用いた方法は、動物個体のゲノムに外来遺伝子が挿入される懸念があり、このことは動物が持つ本来の遺伝子を破壊してしまうリスクを含んでいることを意味します。そこで、研究グループは、ｍＲＮＡが通常ではゲノムへ組み込まれないことを利用し、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと体細胞核移植技術と組み合わせることにより、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクのない安全なノックアウトブタの作出を試みました。
免疫機能のない（免疫不全）動物は拒絶反応を起こさないため、同種のみならず、異種動物の細胞・組織の移植が可能です。このため、がん研究、ヒトｉＰＳ細胞などの幹細胞移植研究、創薬研究など、さまざまな研究に非常に有用であることから、新手法を用いて免疫不全ブタ（ＳＣＩＤブタ）の作出に取り組みました。
＜研究の内容＞
ヒトＳＣＩＤの多くは、インターロイキン２受容体γ鎖（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子の変異により起こることが知られ、実際にＩＬ２ＲＧをノックアウトしたマウス、ラット、ブタはヒトと同様の症状が現れることが知られています。従って、免疫不全ブタを作出するにあたり、ＩＬ２ＲＧ遺伝子をノックアウトすることに決めました。ＤＮＡと異なりｍＲＮＡが通常ゲノムへ組み込まれないことを利用して（図１）、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを合成し、これを体細胞である皮膚由来線維芽細胞へ導入しました。これにより、一時的にジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させ、遺伝子挿入を起こさせずに目的の遺伝子に変異を誘導し、体細胞核移植に使用するＩＬ２ＲＧ遺伝子の機能を消去したノックアウト細胞（核ドナー細胞）を得ました。一般に、体細胞を用いた相同組み換えの頻度は非常に低く（１００万個から１億個の細胞あたり１回程度）、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した本研究ではその１万倍以上の効率で変異を導入することができました（図２）。さらに、通常１２ヵ月は要する時間を約６ヵ月へと短縮し、ＩＬ２ＲＧノックアウト個体を得ることができました。
作出されたＩＬ２ＲＧノックアウトブタは、ＩＬ２ＲＧの発現が完全に欠損し、免疫に必須な器官として知られる胸腺を欠失していました。また、免疫細胞であるリンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を欠損している（図３）ことが明らかとなり、作出したブタはヒトＳＣＩＤと同様の症状が現れることを確認しました。
今回、作出したＳＣＩＤブタは、通常の飼育環境では免疫不全により死んでしまうため、分娩を行いませんでしたが、すでに樹立している核ドナー細胞から体細胞核移植を行うことにより、同じＳＣＩＤブタの再作出が可能です。
＜今後の展開＞
本研究で作出されたＩＬ２ＲＧノックアウトブタは、ヒトの重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）と同様の症状が現れたことから、よりヒトの病態を忠実に再現するＳＣＩＤモデル動物として、ＳＣＩＤ患者由来ｉＰＳ細胞を用いた幹細胞移植治療法の検討などＳＣＩＤ患者の治療法の確立に大きく貢献します。
また、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの利用と体細胞核移植技術を組み合わせにより、目的以外の遺伝子機能を傷つけるリスクなく、短期間で効率的に遺伝子ノックアウトブタを作出することが可能となったことは、今後さまざまな遺伝子に対するノックアウトブタ作出への利用が大きく見込まれます。これにより疾患モデルブタや異種移植ドナーブタなどを用い、ヒトｉＰＳ細胞の機能・安全性評価、ヒト組織・臓器の再生、がんなどのさまざまな医学研究に利用されるブタの開発が大きく加速し、げっ歯類モデルなどの小動物だけでは得られない、よりヒトに近い知見を得られることが期待されます。
今後は、本研究で作出したＩＬ２ＲＧノックアウトブタをベースとして、免疫に関与する遺伝子のさらなるノックアウトを試み、より重篤な免疫不全ブタの開発を目指し、再生医学研究の発展に貢献することが期待されます。
＜参考図＞
図１ 遺伝子ノックアウトに伴う外来遺伝子挿入のリスク
従来の相同組み換え（Ａ）による方法は、遺伝子機能をなくすためにターゲティングベクターの導入が必須である。また、プラスミドＤＮＡを用いたジンクフィンガーヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウト方法（Ｂ）においても外来遺伝子の挿入リスクがある。本研究で開発した新手法（Ｃ）では、外来遺伝子が挿入されることなく遺伝子ノックアウトを行うことが可能である。
図２ 本研究の概要
ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを皮膚由来の線維芽細胞に導入し、外来遺伝子導入のない遺伝子ノックアウト細胞（核ドナー細胞）を樹立。除核したブタの卵に核ドナー細胞を挿入する体細胞核移植を行い、構築した初期胚を代理母に胚移植し、免疫のないブタを作出した。作出したブタは免疫機能がないことから、出産してもすぐに死んでしまうため、帝王切開により分娩直前で回収。免疫のないブタは、ヒト免疫不全症を忠実に再現するモデル動物として、幹細胞治療やがん治療法の評価・開発、そしてヒト臓器再生研究への利用が期待されます。
図３ 免疫のないブタの免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の欠損
正常なブタ（左）には免疫細胞であるＴ細胞の分化、成熟を行う器官である胸腺があるが（白矢頭）、免疫のないブタ（右）では欠失している。また、免疫細胞であるＴ細胞、ＮＫ細胞も欠損している。
＜用語解説＞
- 注１） 重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）
- 重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ：ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、生体の防御機構である免疫に関わるＴ細胞やＢ細胞の欠損または機能異常により、免疫不全となる疾患。これまでＳＣＩＤはいくつかの遺伝子の変異により引き起こされることが知られているが、そのうちＩＬ２ＲＧ遺伝子の変異が最も多い。液性・細胞性免疫の欠如により、生後数週間以内から細菌、ウイルスなどすべての病原体に対する易感染性を示すようになり、早期に造血幹細胞移植が行われなければ、乳児期に死に至る。
- 注２） ノックアウト
- 遺伝子の機能を欠損させる遺伝子工学技術の１つ。遺伝子ノックアウトは相同組み換えによる方法、最近ではジンクフィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集ツールを用いて行うことにより可能である。特定の遺伝子を不活性化させ、正常個体と比較することで、その遺伝子の機能を推定することができる。遺伝子ノックアウト動物は、遺伝子ノックアウトの技法によって１個以上の遺伝子が無効化された動物であり、疾患原因の解明、治療法の開発などに大きく貢献している。
- 注３） 相同組み換え
- 組み換えは、異なるＤＮＡ分子間で塩基配列がよく似た部位（相同部位）で起こる遺伝子の組み換えであり、さまざまな化学物質や放射線により切断されたＤＮＡは主に相同組み換えによって修復されることが知られている。この性質を利用して、対象とする遺伝子と相同の配列を両端に持つターゲティングベクターを用いることで、相同組み換えを誘導し、結果的に遺伝子をノックアウトすることが可能である。しかし、標的とする遺伝子で相同組み換えが起こる頻度が非常に低く、効率が悪い。マウスでは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた相同組み換えにより、これまで多くの遺伝子ノックアウトマウスが作製されてきた。
- 注４） ジンクフィンガーヌクレアーゼ
- ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーと呼ばれるＤＮＡに結合する性質を持つたんぱく質のドメインと、ヌクレアーゼと呼ばれるＤＮＡを切断するハサミの役割を果たすたんぱく質のドメインから成る人工酵素。ジンクフィンガードメインは任意のＤＮＡ配列を認識するように改変が可能であり、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム中の特定の遺伝子を標的とし、ＤＮＡを切断することができる。ＤＮＡ切断後は、生体が持つＤＮＡ修復機構を利用して再度つなぐことで、ゲノムＤＮＡを自在に切り繋ぎし編集することができる。２００９年、世界で初めてジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、遺伝子ノックアウトラットが作製され、生物種を問わず遺伝子ノックアウトを可能とする革新的ツールである。
- 注５） 体細胞核移植技術
- 体細胞核移植技術（体細胞クローニング）とは、核を除いた未受精卵へ体細胞の核を移植（融合）することによって、作製した初期胚を代理母に移し、個体（クローン）を作出する方法。誕生した子は、元の体細胞の核と同一の遺伝情報を持つ。１９９６年に世界で初めて体細胞クローンヒツジの「ドリー」が誕生。
＜論文タイトル＞
“Generation of Interleukin-2 Receptor Gamma Gene Knockout Pigs from Somatic Cells Genetically Modified by Zinc Finger Nuclease-Encoding mRNA”
（ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いた免疫不全ブタの作出）
doi: 10.1371/journal.pone.0076478
＜お問い合わせ先＞
＜研究に関すること＞
渡邊 將人（ワタナベ マサヒト）
明治大学 バイオリソース研究国際インスティテュート 特任講師
〒214-8571 神奈川県川崎市多摩区東三田１－１－１
Tel：044-934-7165 Fax：044-934-7824
E-mail：
＜ＪＳＴの事業に関すること＞
川口 貴史（カワグチ タカフミ）
科学技術振興機構 戦略研究推進部
〒102-0076 東京都千代田区五番町７ Ｋ’ｓ五番町
Tel：03-3512-3524 Fax：03-3222-2064
E-mail：
＜報道に関すること＞
科学技術振興機構 広報課
Tel：03-5214-8404 Fax：03-5214-8432
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明治大学 経営企画部 広報課 澤内 秀太
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自治医科大学 研究支援課 飯村 久恵
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