患者さん由来ｉＰＳ細胞でアルツハイマー病の病態を解明
ｉＰＳ細胞技術を用いた先制医療開発へ道筋

＜ポイント＞

• アルツハイマー病^注１）患者さんのｉＰＳ細胞^注２）を用いて、若年発症および高齢発症どちらも共通に、アミロイドベータ（Ａβ）^注３）というタンパク質が、細胞内に蓄積するタイプがあることを明らかにした。
• 細胞内に蓄積したＡβは凝集物（Ａβオリゴマー^注４））となり、細胞内ストレスを引き起こしたがＡβ産生阻害剤（ＢＳＩ^注５））もしくはＤＨＡ^注６）投与によりそのストレスは軽減した。
• ｉＰＳ細胞技術による、疾患の病態解明および創薬研究に加え、「病態を予め予測し、適切な治療を提供する先制医療^注７）」への道筋を示した。

１．要旨

近藤 孝之　大学院生（京都大学 大学院医学研究科 脳病態生理学講座臨床神経学（高橋 良輔　教授）／ＣｉＲＡ　リサーチアシスタント／ＪＳＴ ＣＲＥＳＴ）、井上 治久　准教授(京都大学 ＣｉＲＡ／ＪＳＴ ＣＲＥＳＴ／ＪＳＴ 山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト)、岩田 修永　教授（長崎大学 薬学部／ＪＳＴ ＣＲＥＳＴ）の研究グループは、山中 伸弥　教授(京都大学 ＣｉＲＡ／ＪＳＴ 山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト)らの研究グループと協力し、複数のアルツハイマー病（ＡＤ）の患者さんごとに存在する病態を明らかにして、ｉＰＳ細胞を用いた先制医療への道筋を示しました。

筆者らは、若年性（家族性）ＡＤの原因遺伝子であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に遺伝子変異を持つ患者さんと、家族歴のない高齢発症（孤発性）ＡＤの患者さんの皮膚からｉＰＳ細胞を作製し、大脳の神経系細胞に分化誘導させました。解析の結果、ＡＰＰ－Ｅ６９３Δと呼ばれる変異があると、アミロイドベータ（Ａβ）というタンパク質がオリゴマーと呼ばれる凝集体となって細胞内に蓄積し、小胞体ストレス^注８）と酸化ストレス^注９）を引き起こし、細胞死を生じ易くすることが分かりました。また、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）によって、これらの細胞内ストレスは軽減され、神経細胞死も抑制されました。さらに高齢発症の孤発性ＡＤ患者さんの中にもＡＰＰ－Ｅ６９３Δ変異と同様の細胞内Ａβオリゴマーおよび細胞ストレスが見られるケースがあることが分かりました。

これらの研究結果は、ｉＰＳ細胞技術応用は、疾患の病態解析や創薬研究に留まらず、孤発性を含めた患者さんごとの病態を事前に把握し適切な治療介入を行う「先制医療」にも用いることができることを示しています。この研究成果は２０１３年２月２１日(米国東部時間)に米国科学誌「Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ」のオンライン版で公開されます。

２．研究の背景

アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年期認知症の中で最も多い疾患であり、その病理特徴としては、脳内に老人斑といわれるタンパク質の蓄積が見られます。この老人斑の主成分がＡβであり、Ａβの過剰な蓄積がアルツハイマー病の発症に深く関わっていると考えられていましたが、病態への関与の仕方は、ヒトの脳の細胞では良く分かっていませんでした。

３．研究結果

１）アルツハイマー病患者さんからｉＰＳ細胞を作製し病態を再現

健常人（コントロール）３名と、ＡＰＰ－Ｅ６９３Δ変異もしくはＡＰＰ－Ｖ７１７Ｌ変異を持つ若年発症の家族性ＡＤ患者２名、さらに家族歴のない高齢発症の孤発性ＡＤの方２名からｉＰＳ細胞を作製しました（図１）。

そしてヒトｉＰＳ細胞から神経系細胞（大脳皮質神経細胞やアストロサイト^注１０））に分化誘導する技術を開発し、患者さんの神経系細胞群をｉｎ　ｖｉｔｒｏ（生体外）で作製しました。するとＡＰＰ－Ｅ６９３Δ変異を持つｉＰＳ細胞由来の神経系細胞で、細胞内にＡβオリゴマーが蓄積し、小胞体ストレスを引き起こしていることが分かりました（図２）。さらに、マイクロアレイチップを用いた網羅的な遺伝子発現解析により、酸化ストレスに応答する遺伝子群の発現が増加していることが明らかになりました。また、活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）^注１１）が増加していたことから、細胞内Ａβオリゴマーを持つＡＤの神経系細胞内部では細胞内酸化ストレスが引き起こされていますが、それに対して細胞が対抗措置を取り、細胞内環境を正常化しようとしていることが考えられました。

これらの細胞内ストレスはＡβの合成阻害剤であるβセクレターゼ阻害薬（β－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＢＳＩ）によりＡβを取り除くと改善されました。

２） Ａβによる細胞内のストレスは、適切な濃度のＤＨＡで改善する

ＡＰＰ－Ｅ６９３Δ変異を持つｉＰＳ細胞由来の神経系細胞に対して、３種の化合物（活性酸素の生成阻害剤や小胞体ストレスを軽減する試薬など）を添加し、小胞体ストレスに対する治療効果を調べました。すると、低濃度のＤＨＡを添加した時のみ、小胞体ストレスに応答するタンパク質（ＢｉＰ、Ｃａｓｐａｓｅ－４）や酸化ストレス（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ－４、活性酸素種）を減らしましたが、残り２種の化合物や高濃度のＤＨＡでは逆に小胞体ストレスを増強してしまいました。さらに、低濃度のＤＨＡを添加することで、ＡＰＰ－Ｅ６９３Δ変異を持つｉＰＳ細胞由来神経細胞の自然細胞死を、改善させることができました。この結果は、適切な有効濃度が存在することを示しています（図３）。

３） 一部の孤発性ＡＤにおいても細胞内Ａβオリゴマーと細胞ストレスが観察された

若年発症型の家族性ＡＤのみでなく、家族歴のない高齢発症の孤発性ＡＤの患者さんにおいても解析を進めると、一名の方においてはＡＰＰ－Ｅ６９３Δ変異と同様に細胞内Ａβ蓄積や細胞ストレスが見られ、低濃度ＤＨＡで細胞ストレスを除去することができました。

この結果は、ＤＨＡによる処置が有効であるアルツハイマー病の集団と有効でない集団が存在する可能性を示しています。つまり、一見同じに見えるＡＤも、背景にひそむ病態は多様であり、病態特性に応じた治療戦略が必要であるということです。そして、ｉＰＳ細胞技術による疾患を先制的に治療制御する医療への道筋を提示しています。

４．まとめ

本研究では、若年発症型および高齢発症の孤発性アルツハイマー病患者さんの神経細胞・アストロサイト内にＡβオリゴマーが蓄積し、種々の細胞ストレスを引き起こしているケースがあることを明らかにしました。

より表現型の強い若年発症型アルツハイマー病患者さんのｉＰＳ細胞を用いて、病態解析や創薬研究のプラットフォームを開発し、孤発性アルツハイマー病患者さんのｉＰＳ細胞をそのプラットフォーム上で解析することで、患者さんの大部分を占める孤発性アルツハイマー病治療開発を推進する新たな方向性を示しました。

これらの成果を推し進めることで、従来の均一な疾患概念に対する画一的な治療を超えて、先制的な病態診断に基づき適切な治療を行う「先制医療」の開発が今後の課題であり、そのためには、ｉＰＳ細胞技術のさらなる進展が必要であると考えられます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） アルツハイマー病（ＡＤ）

ドイツの精神科医、アルツハイマー博士により１９０５年に報告された進行性の記憶障害を伴う認知症。中高年で発病し、徐々に進行して生活に支障をきたすようになり、最終的には意思疎通ができなくなる。その病理特徴としては、脳内に老人斑といわれるタンパク質の沈着が見られ、この老人斑の主成分がＡβであることから、Ａβの過剰な蓄積がアルツハイマー病の発症に深く関わっていると考えられてきた。

注２） ｉＰＳ細胞

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）のこと。体細胞に特定因子を導入することにより樹立される、ＥＳ細胞に類似した多能性幹細胞。２００６年に山中教授らの研究により世界で初めてマウス体細胞を用いて樹立に成功したと報告された。

注３） アミロイドベータ（Ａβ）

４０～４３個のアミノ酸が連なってできたペプチド（タンパク質断片）で、アミロイド β　前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が、酵素であるγセクレターゼやβセクレターゼによって分解されることで生じる。ＡＤでは、Ａβが凝集して線維状になり、脳に沈着することが昔から良く知られている。

注４） Ａβオリゴマー

Ａβが数個～十数個集まった凝集物のことで、アミロイドを作る線維状Ａβとは区別されている。ＡＤ患者さんの中には、脳の老人斑（線維状のＡβ）がみられない方もおられるので、現在、ＡβオリゴマーとＡＤとの関係が詳しく調べられている。

注５） ＢＳＩ（β－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）

Ａβ産生に関与するβセクレターゼの阻害薬。βセクレターゼに結合し、前駆体タンパク質からＡβが生成するのを阻害する化学物質のこと。

注６） ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）

不飽和脂肪酸の一種で、主に細胞膜に存在する。魚油に多く含まれており、体内ではαリノレン酸から合成される。但し、α－リノレン酸は体内で合成することができない。

注７） 先制医療

病気の原因や進行に関する研究知見を基に、体内の異常を早期に診断し、病気を発症する前から治療を開始することで、病気の発症を遅らせる、もしくは防ぐことを目指す医療のこと。

注８） 小胞体ストレス

細胞内で生産されたタンパク質が正しい立体構造へと折りたたまれず、細胞小器官である小胞体に蓄積してしまうことで引き起こされるストレス反応のこと。小胞体ストレスが起きると、細胞内のタンパク質生産量が減り、小胞体でのタンパク質の折りたたみ負荷が減ったり、折りたたみを助けるタンパク質が増えたり、折りたたみがうまくいかなかったタンパク質の分解効率が増える。あまりにも大きな小胞体ストレスがかかった場合には、細胞死が起きる。

注９） 酸化ストレス

通常、生体内では活性酸素が生成したとしても、それらの除去（抗酸化作用）がすみやかに行われるが、このバランスが崩れ、活性酸素の生成が増えた時に、ＤＮＡやタンパク質、脂質などが攻撃を受けて、最終的にはさまざまな細胞小器官や細胞自身が傷つくこととなる状態のこと。

注１０） アストロサイト

中枢神経系に存在する脳内最大の細胞集団で、神経細胞を取り囲み、神経活動を修飾したり、血流を調節したりすることで、神経ネットワークを支える働きがある。

注１１） 活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）

細胞が酸素を使った呼吸をする際に生じる反応性の高い酸素のこと。多くの場合は、抗酸化物質や抗酸化酵素によって除去されるが、過剰に生じると、多くの物質と反応しやすい性質のため、酸化ストレスを引き起こす。細胞内での情報伝達、代謝調節などに加え、感染が起こった時に白血球が活性酸素で細菌を攻撃するなどの生理機能を持つ。

注１２） ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）

研究領域	「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）作製・制御等の医療基盤技術」 　（研究総括：須田 年生　慶應義塾大学 医学部　教授）
研究課題名	「ｉＰＳ細胞を駆使した神経変性疾患病因機構の解明と個別化予防医療開発」
研究代表者	井上 治久（京都大学 ｉＰＳ細胞研究所　准教授）
研究期間	平成２１年１０月～２７年３月

ＪＳＴはこの領域で、ｉＰＳ細胞を基軸とした細胞リプログラミング技術の開発に基づき、その技術の高度化・簡便化をはじめとした研究によって、革新的医療に資する基盤技術の構築を目指している。上記研究課題では、基礎および臨床の研究者を結集して、患者由来ｉＰＳ細胞を用いて神経変性疾患の病因メカニズムの解明および個別化予防医療開発を目的としている。

６．論文名、著者およびその所属

○論文名

“Modeling Alzheimer's disease using iPSCs reveals stress phenotypes associated with intracellular Aβ and differential drug responsiveness”
doi: 10.1016/j.stem.2013.01.009

○ジャーナル名

Cell Stem Cell

○著者

Takayuki Kondo,1,2,7 Masashi Asai,7,9,10 Kayoko Tsukita,1,7 Yumiko Kutoku,11 Yutaka Ohsawa,11 Yoshihide Sunada,11 Keiko Imamura,1 Naohiro Egawa,1 Naoki Yahata,1 Keisuke Okita,1 Kazutoshi Takahashi,1 Isao Asaka,1 Takashi Aoi,1 Akira Watanabe,1 Kaori Watanabe,7,10 Chie Kadoya,7,10 Rie Nakano,7,10 Dai Watanabe,3 Kei Maruyama,9 Osamu Hori,12 Satoshi Hibino,13 Tominari Choshi,13 Tatsutoshi Nakahata,1 Hiroyuki Hioki,4 Takeshi Kaneko,4 Motoko Naitoh,5 Katsuhiro Yoshikawa,5 Satoko Yamawaki,5 Shigehiko Suzuki,5 Ryuji Hata,14 Shu-ichi Ueno,15 Tsuneyoshi Seki,16 Kazuhiro Kobayashi,16 Tatsushi Toda,16 Kazuma Murakami,6 Kazuhiro Irie,6 William L. Klein,17 Hiroshi Mori,18 Takashi Asada,19 Ryosuke Takahashi,2 Nobuhisa Iwata,7,10,^* Shinya Yamanaka,1,8 and Haruhisa Inoue1,7,8,^*

*) 責任著者

○著者の所属機関

• １　　京都大学 ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）
• ２　　京都大学 大学院医学研究科 脳病態生理学講座臨床神経学（神経内科）
• ３　　京都大学 大学院医学研究科 生体情報科学
• 　京都大学 大学院生命科学研究科 認知情報学
• ４　　京都大学 大学院医学研究科 高次脳形態学
• ５　　京都大学 大学院医学研究科 形成外科
• ６　　京都大学 大学院農学研究科 食品生物科学専攻
• ７　　科学技術振興機構（ＪＳＴ） ＣＲＥＳＴ
• ８　　科学技術振興機構（ＪＳＴ） 山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト
• ９　　埼玉医科大学 医学部
• １０　長崎大学 薬学部
• １１　川崎医科大学
• １２　金沢大学 大学院医学研究科
• １３　福山大学 薬学部
• １４　愛媛大学 大学院医学研究科機能組織学
• １５　愛媛大学 大学院医学研究科精神科
• １６　神戸大学 大学院医学研究科
• １７　ノースウェスタン大学（ＵＳＡ）
• １８　大阪市立大学 大学院医学研究科
• １９　筑波大学 大学院人間総合科学研究科（臨床医学系）

７．本研究への支援

本研究は、下記機関より資金的支援を受けて実施されました。

• ＪＳＴ ＣＲＥＳＴ^注１２）
• ＪＳＴ 山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト
• 内閣府「最先端研究開発支援プログラム（ＦＩＲＳＴ）」
• 文部科学省 科学研究費補助金 新学術領域研究「シナプス病態」
• 厚生労働科学研究費補助金（ｉＰＳ細胞を利用した創薬研究支援事業）
• 厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患克服研究事業 疾患特異的ｉＰＳ細胞を用いた難治性疾患の画期的診断・治療法の開発に関する研究）
• 厚生労働科学研究費補助金（障害者対策総合研究事業（神経・筋疾患分野））
• 臨床薬理研究振興財団研究基金

＜研究に関するお問い合わせ先＞

＜本件担当＞

京都大学 ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）
研究支援部門　国際広報室
遠山
TEL：075-366-7005
FAX： 075-366-7023
E-mail：