Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を
網羅的に検出する手法を確立
～新しいくすりの開発に貢献～

ポイント

• くすり開発の重要な標的分子であるＧタンパク質共役型受容体に関して、新しい活性化検出法を開発
• 既存の手法を大幅に上回る検出効率であることを実証
• ３種類のＧタンパク質共役型受容体について、活性化分子を初めて同定
• 新しいくすり開発の効率化へ期待

＜背景＞

細胞は外界との情報の受け渡しをさまざまな分子を介して行います。細胞外からの情報を受け取るタンパク質は受容体と呼ばれ、その中でもＧＰＣＲと呼ばれる一群の受容体が最も重要な役割を担うことがわかっています。ＧＰＣＲは全タンパク質の中で最大の遺伝子ファミリーを形成しており、ヒトゲノム中には８００種類以上ものＧＰＣＲが存在しています。ＧＰＣＲは細胞膜上に存在し、細胞外から運ばれてくるホルモンや成長因子などと結合し、細胞内へ信号（シグナル）を伝えています。また、ＧＰＣＲの機能の異常は多くの疾患を引き起こすことがわかっています。病態時のＧＰＣＲの機能異常を正すことは、病気の治療につながります。実際、ＧＰＣＲを標的としたくすりは数多く開発が成功しており、現在市販されているくすりの半数近くにものぼります。従って、ＧＰＣＲの機能を理解することは、創薬開発の近道であると言えます。

ＧＰＣＲの役割は細胞外の結合分子（リガンド）の量を感知して、細胞内へシグナルを伝えることです。ＧＰＣＲはリガンドと結合すると構造変化（活性化）を起こし、三量体Ｇタンパク質^注３）と呼ばれる細胞内タンパク質を呼び寄せ、さまざまな下流のシグナルを誘導します。三量体Ｇタンパク質はＧ_ｓ、Ｇ_ｉ、Ｇ_ｑ、Ｇ_{１２／１３}の４種類に大別され、それぞれの下流では、サイクリックＡＭＰ濃度の変動（Ｇ_ｓ、Ｇ_ｉ）、細胞内カルシウム濃度の変動（Ｇ_ｑ）、低分子量Ｇタンパク質ＲｈｏへのＧＴＰ結合（Ｇ_{１２／１３}）が起こります。このような細胞内イベントを検出することで、ＧＰＣＲの活性化を測定することができます。しかし、ＧＰＣＲは通常１種類か２種類の三量体Ｇタンパク質としか結合（共役とも呼ばれます）しないことから、特定の細胞内イベントを観察するだけでは、多くても半数程度のＧＰＣＲの活性化しか検出することができません。そこで、多くのＧＰＣＲの活性化を同一の方法で検出できるような新規ＧＰＣＲ活性化測定法が期待されていました。特に、Ｇ_{１２／１３}の下流での細胞内シグナルを定量的に検出する手法の開発は遅れており、Ｇ_{１２／１３}と結合するＧＰＣＲの機能を解明する上で大きな障害となっていました。

青木 淳賢　教授と井上 飛鳥　助手は以前の研究成果（ＥＭＢＯ　Ｊ．　３０，　４２４８－４２６０（２０１１））において、毛の成長に生理活性脂質リゾホスファチジン酸とその受容体（ＬＰＡ_６、ＧＰＣＲの１種）が必須の役割を果たしていることを見出しました。ＬＰＡ_６の下流の分子機構を詳細に調べたところ、毛根の上皮細胞においてＴＡＣＥ^注４）と呼ばれる膜型タンパク質分解酵素が活性化し、トランスフォーミンング増殖因子α（ＴＧＦα）^注５）の膜結合前駆体を切断し、細胞外へ放出するという現象がわかりました。そして、このＬＰＡ_６－ＴＡＣＥ－ＴＧＦαの経路が、正常な毛根の成長に必須であることを発見しました。この研究過程から、ＴＡＣＥによるＴＧＦαの切断という現象を培養細胞中で再現することで、ある種のＧＰＣＲの活性化が検出可能になるのではないかと想定しました。

＜今回の発見＞

青木 淳賢　教授と井上 飛鳥　助手は上述の背景を受け、ＴＡＣＥによるＴＧＦαの切断がＧＰＣＲの下流で普遍的に起こる現象かどうか検討しました。まず、リガンドが既に知られている１１６種類のＧＰＣＲとそのリガンドの組み合せで調べました。ヒト腎臓由来の細胞株であるＨＥＫ２９３細胞にＧＰＣＲをコードする遺伝子とアルカリホスファターゼ融合ＴＧＦα（ＡＰ－ＴＧＦα、愛媛大学 東山 繁樹　教授が確立）をコードする遺伝子をリポフェクション法^注６）で導入し、この細胞をそれぞれのＧＰＣＲのリガンドで刺激した後に、細胞外へのＡＰ－ＴＧＦαの放出量を評価しました。その結果、実に７割ものＧＰＣＲの活性化が本法（ＴＧＦα切断アッセイ、ＴＧＦα　ｓｈｅｄｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ（図１）と命名）で検出できることがわかりました。また、ＴＧＦα切断を引き起こしたＧＰＣＲの特徴を調べると、Ｇ_ｑまたはＧ_{１２／１３}と共役するＧＰＣＲであることがわかりました。そこで、Ｇ_ｓやＧ_ｉのシグナルをそれぞれＧｑやＧ_{１２／１３}のシグナルに変換することのできるキメラＧタンパク質^注７）を導入したところ、１１６種類のＧＰＣＲのうち１０４種類のＧＰＣＲの活性化を検出することに成功しました。このようにＴＧＦα切断アッセイは９０％以上のＧＰＣＲについて活性化を検出し、この割合は既存の手法を大きく超えることから本法の有用性が示されました。また、本法は作動薬や遮断薬^注８）の反応を検出できるだけでなく、創薬に最も有効であると考えられている逆作動薬^注８）の検出にも有効でした。

また、本手法を用いリガンド未知のオーファンＧＰＣＲ^注９）のリガンド探索を行いました。その結果、３つのＧＰＣＲ（Ｐ２Ｙ１０、ＧＰＲ１７４、Ａ６３００３３Ｈ２０）が生理活性脂質のリゾホスファチジルセリンに応答することを発見しました（図２）。これらの受容体はいずれもＧ_{１２／１３}に共役すること、リゾホスファチジルセリンの構造類似体（東京大学の大和田 智彦　教授、新井 洋由　教授により有機合成）の反応性からリゾホスファチジルセリンの構造を厳密に認識する受容体であることが判明しました。リゾホスファチジルセリンは、リンパ球の増殖抑制やマスト細胞の活性化などの作用が知られており、これら３つのＧＰＣＲの研究を通じて生体内の新たな生理活性物質の解明が進むことが期待されます。

＜意義＞

これまで、Ｇ_{１２／１３}と共役するＧＰＣＲは活性化の検出が困難であり、作動薬、遮断薬の開発が遅れていました。本研究で開発されたＴＧＦα切断アッセイを用いることで、これまで困難であったＧ_{１２／１３}と共役するＧＰＣＲに対する創薬が一気に加速化されるものと期待されます。また、本手法はオーファンＧＰＣＲのリガンド同定や、リガンドの作用様式の評価に極めて有効であり、新規創薬への貢献が大いに期待されます。今回、リゾホスファチジルセリンに反応するＧＰＣＲを複数発見したことで、未解明な点が多く残るこの生理活性脂質の研究が加速することが期待されます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） ＧＰＣＲ：Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）

細胞膜上に存在する受容体で、細胞膜を７回貫通する特徴的な構造を有しており、７回膜貫通型受容体とも呼ばれています。これまでに開発されたくすりの大半がＧＰＣＲと結合して作用を発揮することから、現在も創薬の重要標的分子として盛んに研究されています。ヒトにおいては８００種類以上存在し、そのうち構造や発現部位から約２８０種類が創薬標的の候補と考えられています。

注２） リゾホスファチジルセリン：生理活性脂質の一種

リンパ球の増殖抑制、マスト細胞の活性化などの作用を持つ生理活性脂質です。いつどこで産生されて、どの受容体を介して機能しているかなど、未解明な点が多く残されていました。今回の３つの受容体の発見から、特に免疫系での機能が着目されます。

注３） 三量体Ｇタンパク質：Ｇα、Ｇβ、Ｇγの３つのサブユニットタンパク質の複合体

三量体Ｇタンパク質は活性化ＧＰＣＲ（リガンド結合による構造変化）と結合し、ＧＤＰ結合型からＧＴＰ結合型に変化する。ＧＴＰ結合型の三量体Ｇタンパク質は活性化型と呼ばれ、各種の細胞内シグナルを誘導します。複合体のうち、Ｇαが最も重要でＧＰＣＲとの結合や下流に伝えるシグナルの種類を決めます。伝えるシグナルの種類とアミノ酸配列の相同性から、三量体Ｇタンパク質はＧ_ｓ、Ｇ_ｉ、Ｇ_ｑ、Ｇ_{１２／１３}の４種類に分類され、それぞれＧα_ｓ、Ｇα_ｉ、Ｇα_ｑ、Ｇα_{１２／１３}サブユニットを含みます。

注４） ＴＡＣＥ：腫瘍壊死因子変換酵素（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）

膜結合型のタンパク質分解酵素で、膜タンパク質の細胞外部分を切断します。さまざまなタンパク質がＴＡＣＥにより切断されることが知られていますが、そのうちの１つがＴＧＦαです。

注５） ＴＧＦα：トラスフォーミンング増殖因子α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－α）

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のリガンドの１つです。１回膜貫通型の前駆体タンパク質として産生されます。ＴＡＣＥにより切断され、細胞外部分が放出されます。今回使用したＡＰ－ＴＧＦαは細胞外領域にアルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を融合するように設計した改変型ＴＧＦαで、放出されたＴＧＦαはアルカリホスファターゼの活性を指標に簡便に測定することができます。

注６） リポフェクション法：遺伝子導入の一手法

リポソームと呼ばれる脂質と遺伝子の入ったプラスミドベクターとの混合液を細 胞にかけると、目的の遺伝子を細胞に導入することができます。細胞内で遺伝子からタンパク質が作られます。今回のＴＧＦα切断アッセイでは、複数種類のプラスミドベクター（ＡＰ－ＴＧＦα、ＧＰＣＲ、キメラＧタンパク質）を同時に細胞に導入します。

注７） キメラＧタンパク質：Ｇαサブユニットを改変した三量体Ｇタンパク質

Ｇαタンパク質のカルボキシル末端（Ｃ末）側部分がＧＰＣＲとの結合を担います。Ｇαタンパク質のＣ末側の６アミノ酸残基を他のＧαタンパク質と交換することで、下流に伝えるシグナルは変えずに、ＧＰＣＲとの結合を変化させることができます。例えば、Ｇα_ｑの骨格とＧα_ｓのＣ末を持つキメラＧタンパク質を用いると、通常はＧ_ｓに共役しているＧＰＣＲのシグナルをＧ_ｑに変換することができます。

注８） 作動薬、遮断薬、逆作動薬：リガンドの作用形式の分類

作動薬（アゴニスト）はＧＰＣＲに対して活性化する薬剤です。遮断薬（アンタゴニスト）と逆作動薬（インバースアゴニスト）はＧＰＣＲの活性化を抑えます。逆作動薬はＧＰＣＲを不活性型に構造変化させることができ、市販されている薬剤の多くは遮断薬ではなく逆作動薬であることが知られています。

注９） オーファンＧＰＣＲ：孤児Ｇタンパク質共役型受容体

リガンドが不明なＧＰＣＲの総称で、現在約８０種類存在します。リガンドを同定することが、生体内の役割を解明する第一歩となります。しかし、多くの場合どの三量体Ｇタンパク質と共役するか不明なため、ＧＰＣＲ検出系を複数用意する必要があります。今回確立したＴＧＦα切断アッセイを用いることで、効率的にオーファンＧＰＣＲのリガンド同定を行うことができると期待されます。

＜論文目録＞

論文タイトル：TGFα shedding assay: an accurate and versatile method for detecting GPCR activation
（TGFα切断を用いた正確かつ汎用性の高いGPCR活性化測定法の確立）
雑誌名：Nature Methods
電子版2012年9月16日（現地時間）、冊子版2012年10月号
doi: 10.1038/NMETH.2172

＜お問い合わせ先＞

＜研究に関すること＞

青木 淳賢（アオキ ジュンケン）
東北大学 大学院薬学研究科 分子細胞生化学分野　教授
Tel：022-795-6860
E-mail：

井上 飛鳥（イノウエ アスカ）
東北大学 大学院薬学研究科 分子細胞生化学分野　助手
Tel：022-795-6861
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＜ＪＳＴの事業に関すること＞

石井 哲也（イシイ テツヤ）
科学技術振興機構 戦略研究推進部
Tel：03-3512-3524
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