共同発表：タンパク質合成因子のＲＮＡ合成における新たな役割を解明－翻訳因子がＲＮＡ合成因子として働いていた可能性

■　ポイント　■

Ｘ線結晶構造解析手法と機能解析手法を用い、ウイルスＲＮＡ合成酵素と宿主翻訳因子が形成する複合体によるＲＮＡ合成過程を詳細に解析
宿主翻訳因子がＲＮＡウイルスのＲＮＡ合成の伸長反応を促進する別機能を有することを発見
太古では翻訳因子が元来ＲＮＡ合成の因子としての機能を有していた可能性を示唆

■ 概　要 ■

独立行政法人産業技術総合研究所【理事長　野間口有】（以下「産総研」という）バイオメディカル研究部門【研究部門長　織田雅直】ＲＮＡプロセシング研究グループ　富田耕造　研究グループ長、竹下大二郎　研究員らは、Ｑβウイルス^注１）由来のＲＮＡ^注２）合成酵素（β－サブユニット）と宿主^注３）（大腸菌）由来の２つの翻訳因子^注４）が複合体を形成し、複合体中の翻訳因子がＲＮＡの合成伸長過程を促進する新たな機能を有することを発見した。この発見は、ＲＮＡをゲノム^注５）として有していたと考えられる太古生命体では、翻訳因子がＲＮＡ合成酵素の補因子としての役割を担っていた可能性を示唆する。

本研究は独立行政法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）戦略的創造研究推進事業個人型研究（さきがけ）「ＲＮＡと生体機能」研究領域【研究総括：微生物化学研究所長　野本明男】における研究課題「ＲＮＡ末端合成プロセス装置の分子基盤」、独立行政法人日本学術振興会（ＪＳＰＳ）　最先端次世代開発支援プログラム（ＮＥＸＴＰｒｏｇｒａｍ）「ＲＮＡ合成酵素の反応制御機構の解明（代表者：富田耕造）」の一環として行われた。また、Ｘ線回折データは大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構（ＫＥＫ）のフォトンファクトリーを利用して取得した。本成果は、２０１２年１月１６日（日本時間）に、「 ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ 」のオンライン版に掲載される。

ＲＮＡ合成伸長過程のＱβウイルスＲＮＡ合成酵素－翻訳因子複合体のＲＮＡ合成伸長過程の構造

ＲＮＡ合成酵素：β－サブユニット（緑）、翻訳因子ＥＦ－Ｔｕ（赤）、ＥＦ－Ｔｓ（青）、鋳型ＲＮＡ（スティック表示：青）、合成されたＲＮＡ（スティック表示：赤）

＜研究の社会的背景＞

ＲＮＡウイルスのゲノムの宿主内での複製^注６）や転写^注６）のプロセスの大部分は宿主由来のタンパク質を必要とするが、複製、転写の際のＲＮＡ合成はウイルス自身が有するＲＮＡ合成酵素がその触媒活性を担っている。一部のＲＮＡウイルスでは、ＲＮＡゲノムの複製、転写を担うウイルス由来のＲＮＡ合成酵素が、宿主の翻訳因子と複合体を形成し、その複合体形成がＲＮＡウイルスのゲノムの転写や複製に必須であることが知られている。ウイルス由来のＲＮＡ合成酵素と宿主の翻訳因子との複合体形成やＲＮＡウイルスのゲノムの宿主内での複製、転写における宿主翻訳因子の役割を分子レベルで解明することは、新たな抗ウイルス剤の開発の基盤につながると期待されている。また、現存するほとんどの生物では、ＲＮＡを合成するシステムとタンパク質を合成するシステムは互いに独立したプロセスであるが、タンパク質合成に必要な因子がＲＮＡ合成にも必要な因子として組み込まれているウイルスのＲＮＡ合成酵素複合体の研究は、ＲＮＡ合成システムがタンパク質合成システムへと進化した分子レベルでの仕組みや、生命進化における翻訳因子の起源について、学術的に重要な知見が得られる可能性を秘めている。

＜研究の経緯＞

産総研では、ＲＮＡ合成酵素群の研究を行っており、これまで、鋳型を用いないでＲＮＡを合成する酵素群やウイルス由来の鋳型を用いてＲＮＡを合成する酵素の機能、構造、進化、制御機構の研究を推進してきた。さらに、核酸性の鋳型^注７）を用いてＲＮＡを合成するウイルス由来のＲＮＡ合成酵素のうち、大腸菌に感染するＱβウイルス由来のＲＮＡ合成酵素とＱβウイルスに感染した細胞内の翻訳因子との複合体形成機構を解明した（２０１０年８月２４日　産総研・ＪＳＴ共同プレス発表）。今回、このＲＮＡ合成酵素と翻訳因子の複合体が、ＲＮＡの合成を開始しＲＮＡ鎖を伸長、合成していく過程についてＸ線構造解析、また構造をもとにした機能解析を行い、翻訳因子のＲＮＡ合成過程における役割の解明を目指した。なお、Ｘ線回折データはＫＥＫのフォトンファクトリー構造生物学ビームラインＢＬ－１７Ａを利用して取得した。

＜研究の内容＞

翻訳因子であるＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ^注８）は全生物において普遍的に存在し、タンパク質合成における伸長サイクルに必要不可欠なタンパク質である。１９７０年代の初頭に、翻訳因子ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓが大腸菌に感染するＱβウイルスのＱβ複製酵素複合体^注９）を形成する不可欠なサブユニットであることが報告された。この報告は翻訳因子の別の役割、機能を示す最初のものであった。

その後、いくつかの植物、動物、他のバクテリアに感染するＲＮＡウイルスのゲノムにコードされているＲＮＡ合成酵素が宿主由来の翻訳因子と相互作用しうることが報告され、その相互作用がＲＮＡウイルスのゲノムの複製、転写に必要であることが報告されてきた。しかしながら、長年、ウイルスにコードされているＲＮＡ合成酵素が宿主由来の翻訳因子と相互作用し、複合体を形成する分子機構や、複合体中の翻訳因子のタンパク質合成での機能とは異なったＲＮＡ複製、転写における役割については謎であり、その分子機構は明らかにされていなかった。

Ｑβウイルスは、１本鎖ＲＮＡをゲノムとしてもつ、大腸菌に感染するウイルスであり、Ｑβ複製酵素複合体によってそのＲＮＡゲノムの複製、転写を行う。Ｑβ複製酵素複合体はウイルス由来のＲＮＡ合成酵素であるβサブユニット、宿主由来の翻訳因子ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓとリボソームタンパク質Ｓ１^注１０）から構成される。とくにＲＮＡの複製、転写にはβサブユニットとＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓとが３者複合体を形成することが必要である。本研究では、この３者複合体がＲＮＡ合成を開始し、ＲＮＡ鎖が伸長していく過程の複数の構造について、Ｘ線結晶構造解析と構造に基づいた生化学機能解析を行った。

その結果、以下の１）～５）のことが判明した。

１）ＲＮＡ合成開始時には、鋳型となるＲＮＡの３´末端のアデニン（Ａ）^注１１）はＲＮＡ合成の鋳型となるのではなく、ＲＮＡ合成の最初のヌクレオチド（ＧＴＰ）^注２）のグアニン（Ｇ）^注１１）と鋳型ＲＮＡの３´末端から２番目のシトシン（Ｃ）^注１１）との塩基対と相互作用して、開始時の複合体を安定化させ、ＲＮＡ合成開始を効率よく行わせる役割を担っている（図１）。
２）ＲＮＡ合成伸長過程では、８ヌクレオチドの長さのＲＮＡが合成されるまで、合成されたＲＮＡは鋳型ＲＮＡと２重鎖を形成し、その２重鎖は複合体中のＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓの方向へ進行する。この方向は、鋳型ＲＮＡのリン酸骨格がＥＦ－Ｔｕと水素結合を形成することによって決定される（図２）。
３）９ヌクレオチドの長さのＲＮＡが合成されると、鋳型ＲＮＡの３´末端の突出したアデニンはβサブユニットのＣ末端領域（クサビ領域）と相互作用する。その結果、鋳型ＲＮＡと合成されたＲＮＡの間の水素結合は不安定になる（図３左）。
４）１０ヌクレオチドの長さのＲＮＡが合成されると、鋳型ＲＮＡと合成されたＲＮＡからなる２重鎖はさらに複合体中のＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓの方向へ進行し、鋳型ＲＮＡの３´末端の突出したアデニンはクサビ領域やＥＦ－Ｔｕと相互作用することによって反転し、βサブユニットとＥＦ－Ｔｕの間に形成されるトンネル（鋳型ＲＮＡ出口）の方向へ導かれる（図３中央）。また、鋳型ＲＮＡと合成されたＲＮＡからなる２重鎖ＲＮＡ間の水素結合はさらに不安定になる。
５）さらに、ＲＮＡが伸長すると（１４ヌクレオチド）、鋳型ＲＮＡと合成されたＲＮＡの間の水素結合はクサビ領域によってほとんど解かれ、鋳型ＲＮＡは鋳型ＲＮＡ出口トンネルへ入り込み、また合成されたＲＮＡの５´側は複合体から解離する（図３右）。

以上の結果から、ウイルスのＲＮＡ合成酵素と複合体を形成する宿主由来の翻訳因子は、ＲＮＡ合成伸長過程において、鋳型ＲＮＡと合成されたＲＮＡの２重鎖をほどき、効率よくＲＮＡ伸長合成が行われるのを補助するとともに、鋳型ＲＮＡの出口トンネルをＲＮＡ合成酵素と共同で形成することによって、ＲＮＡウイルスのゲノムの転写、複製が完了するまで、鋳型ＲＮＡが複合体から解離してしまうのを防ぐ役割もあることがわかった。

ＲＮＡ分子が化学反応を触媒する機能を有していることが発見され、太古生命体では、生命体を構成する分子はＲＮＡであり、ＲＮＡ分子が遺伝情報の保存分子であり、かつ化学反応を触媒する酵素であったとする「ＲＮＡワールド仮説」が提唱されている。長い年月を経て、ＲＮＡの遺伝情報の保存分子としての役割が化学的に安定なＤＮＡへ、そして、ＲＮＡの酵素活性の役割がタンパク質へと置き換わり、現在の生命になったと考えられている。また、生命の進化において、ＲＮＡ合成－複製システムはタンパク質合成システムよりも先に出現したと考えられている。これらの仮説や考えは多くの研究により支持されている。今回の研究から明らかになった翻訳因子にＲＮＡ合成、伸長を促進する役割があるという事実は、ＲＮＡゲノムからなる太古生命体では、翻訳因子は元来、ＲＮＡゲノムの複製や転写を促進する補因子としての役割を担っており、その後出現した現在のタンパク質合成システムが、このＲＮＡ合成補因子を翻訳因子として取り込んだ可能性を示していると考えられる。

＜今後の予定＞

ウイルスのＲＮＡ合成酵素の中には、宿主由来の翻訳因子以外のタンパク質合成に関わる因子と複合体を形成することも知られている。これらの因子のＲＮＡ合成における機能の解明を行う。また、これらの解析から、生命が進化する過程でＲＮＡの機能がタンパク質へ置き替わる遷移の分子機構、分子進化、ＲＮＡ合成システム、タンパク質合成システムの進化、起源を明らかにしていく。

＜参考図＞

図１　ＲＮＡ合成開始時のＱβウイルスＲＮＡ合成酵素（βサブユニット：緑）と翻訳因子ＥＦ－Ｔｕ（赤）、ＥＦ－Ｔｓ（青）との複合体

鋳型ＲＮＡ（スティック表示：青）、ヌクレオチド（ＧＴＰ：スティック表示：赤）。鋳型ＲＮＡの末端のＡはＧＴＰと鋳型のＣとの塩基対と相互作用し、ＲＮＡ合成複合体を安定化する。

図２　ＱβウイルスＲＮＡ合成酵素複合体によるＲＮＡ伸長過程

合成された７ヌクレオチドＲＮＡと鋳型ＲＮＡの２本鎖（シアン）、合成された８ヌクレオチドＲＮＡと鋳型ＲＮＡの２本鎖（マゼンタ）。

図３　ＲＮＡ伸長過程のＱβウイルスＲＮＡ合成酵素複合体の構造

９ヌクレオチド（左）、１０ヌクレオチド（中央）、１４ヌクレオチド（右）の長さのＲＮＡが合成された状態。

＜用語解説＞

注１）Ｑβウイルス: １本鎖ＲＮＡをゲノムとして有し、大腸菌に感染して増殖するウイルスの一種。このウイルスが感染すると、大腸菌は溶菌し、死滅する。
注２）ＲＮＡ、ヌクレオチド（ＧＴＰ）: 核酸にはＤＮＡとＲＮＡが存在する。ＤＮＡはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの４種類の構成要素（ヌクレオチド）が連結したものであり、一方ＲＮＡはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕの４種類のヌクレオチドが連結したものである。
注３）宿主: 一般に、ウイルスは自分自身だけでは増殖できず、他の生物に感染して、その生物のもつタンパク質などの助けを借りて増殖する。この感染先の生物、細胞のことを宿主（しゅくしゅ）と呼ぶ。
注４）翻訳因子: 生体内でのタンパク質の合成を翻訳という。タンパク質はＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）の配列（遺伝暗号）をもとにして、アミノ酸が連結されたタンパク質へと変換される。翻訳因子は、タンパク質の翻訳過程に関与するタンパク質のことをいう。
注５）ゲノム: 生物のもつ遺伝情報が保存されている分子。通常の生物のゲノムはＤＮＡであるが、ウイルスには、ＲＮＡをゲノムとして有するものがある。
注６）複製、転写: ある核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の配列があるとき、その配列と全く同じ配列の核酸を合成することを複製という。また、ある核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の配列の相補的な配列を合成することを転写という。
注７）核酸性の鋳型: 生体内での核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の合成は通常、その設計図となる核酸配列が存在し、その配列と塩基が対になる配列（相補性：Ａ⇔Ｕ（Ｔ）、Ｃ⇔Ｇ）の塩基が並ぶようにＤＮＡやＲＮＡの合成が行われる。その完成予定の配列の対となる配列を鋳型と呼び、合成される配列は鋳型と相補的である。
注８）ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ: 全ての生物に存在する翻訳伸長因子である。ＥＦはＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒの略。ＥＦ－Ｔｕはアミノ酸の結合したｔＲＮＡをリボソームと呼ばれるタンパク質合成装置へ運搬し、ＥＦ－ＴｓはＥＦ－Ｔｕをリサイクルする役割を果たしている。いずれもタンパク質の合成システムに必須のタンパク質である（下図参照）。
注９）Ｑβ複製酵素複合体: ＱβウイルスゲノムＲＮＡの複製や転写を行う酵素複合体。
注１０）リボソームタンパク質Ｓ１: 生体内でのタンパク質合成はリボソームと呼ばれる複合体で行われる。リボソームは数十種類のタンパク質と３つのＲＮＡからなるが、リボソームタンパク質Ｓ１はリボソームを構成するタンパク質の一種。
注１１）アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）: ヌクレオチドに含まれる塩基。塩基部分がヌクレオチドの特異性を決定する。ＲＮＡは４種類のヌクレオチドからなるが、その塩基部分はグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）である。ＤＮＡの場合、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）　の４種類の塩基がある。