神経細胞にたまった異常タンパク質を分解する新たな制御機構を解明

本研究成果のポイント

• ユビキチン結合タンパク質ｐ６２はリン酸化によって選択的オートファジーを促進
• ｐ６２タンパク質のリン酸化の亢進により異常タンパク質の細胞内蓄積が減少
• 異常タンパク質蓄積に基づく神経変性疾患の治療にも期待

1．背景

アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病などの神経変性疾患に共通する特徴は、神経細胞内に凝集した異常タンパク質の蓄積です。異常タンパク質は細胞毒性を持つため、神経細胞変性や細胞死を引き起こします。細胞にはプロテアソームやオートファジーといった、異常タンパク質を分解し細胞内から除去するためのシステムが備わっていますが、それらを制御するメカニズムについてはまだよく分かっていません。ほとんどの異常タンパク質は、ユビキチン化によって目印がつけられプロテアソームで分解されますが、プロテアソームは凝集した異常タンパク質を壊すことができません。分解できなかった異常タンパク質は選択的オートファジーにより分解されると考えられています。神経変性疾患における神経細胞では、ユビキチン化された異常タンパク質の凝集体が蓄積していることから、選択的オートファジーによる異常タンパク質の分解機構に問題があるのではないかと考えられます。

研究グループは２００４年にハンチントン病を含むポリグルタミン病の主要な病理所見である核内封入体^注７)（核内に凝集した異常タンパク質）に結合するタンパク質を探索し、ｐ６２タンパク質（ｐ６２）を同定しました。異常タンパク質の蓄積やプロテアソームの阻害でｐ６２の発現が増加することが明らかとなり、ｐ６２が異常タンパク質の分解に関与していることが示唆されました。また最近の研究で、オートファジーによるタンパク質分解システムが阻害されると、ｐ６２が核内封入体として蓄積することや、異常タンパク質の蓄積を伴う神経変性疾患の患者の脳組織でｐ６２の蓄積がみられることが報告されています。そこで、研究グループは、ｐ６２の機能に着目し、異常タンパク質の分解メカニズムの解明に挑みました。

2．研究手法と成果

研究グループは、リン酸化などの翻訳後修飾によってｐ６２の機能が制御されていると考え、質量分析によりｐ６２の修飾部位を同定しました。するとｐ６２は多くの部位でリン酸化を受けていることが分かりました（図１Ａ）。次に、これらのリン酸化部位に対する特異的な抗体を作成し、プロテアソームとオートファジーのそれぞれの阻害によってリン酸化が顕著に増加するアミノ酸配列４０３番目のセリン残基（Ｓ４０３）を同定しました（図１Ｂ）。このＳ４０３のリン酸化は脱リン酸化酵素の阻害によって増加することから、細胞内ではＳ４０３リン酸化型ｐ６２と非リン酸化型ｐ６２が平衡状態で共存していることが示唆されました（図１Ｃ）。

さらに、オートファジーを遺伝的に欠失したＡＴＧ５ノックアウトマウスでは、ユビキチン化タンパク質とｐ６２が異常に蓄積することが知られていましたが、ＡＴＧ５ノックアウトマウスの神経細胞を組織染色すると、Ｓ４０３リン酸化型ｐ６２が核内封入体に蓄積していることが分かりました（図２）。試験管内リン酸化反応によってこのＳ４０３をリン酸化する酵素がカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）であることを同定し、ＣＫ２が直接ｐ６２のＳ４０３をリン酸化することを確認しました。また、このＣＫ２を細胞内で過剰発現させるとＳ４０３リン酸化型ｐ６２が増加すると同時にｐ６２の全体量が減少することが分かり、選択的オートファジーによって異常タンパク質とともにＳ４０３リン酸化型ｐ６２の分解が促進されることが示唆されました。

ｐ６２は細胞内でｐ６２小体と呼ばれる顆粒状の構造体を形成することが知られていますが、Ｓ４０３リン酸化型ｐ６２が蓄積する場所を特定するために、蛍光タンパク質で標識して観察したところ、ｐ６２小体内に局在することが分かりました（図３Ａ）。またＳ４０３がリン酸化された状態に似せたｐ６２変異体（Ｓ４０３Ｅ変異体）を細胞で発現すると、野生型と比べてより多くのｐ６２小体を形成しました。さらに、Ｓ４０３Ｅ変異体のｐ６２小体はより多くのユビキチン化タンパク質を取り込んでいることや（図３Ｂ）ｐ６２のＳ４０３リン酸化でユビキチン化タンパク質との結合力が増強されることを明らかにしました。これらの実験結果から、Ｓ４０３リン酸化型ｐ６２がユビキチン化タンパク質と結合してｐ６２小体を形成し、選択的オートファジーのシステムを利用して異常タンパク質の分解を行っていることが示唆されました。

神経変性疾患ではユビキチン化された異常タンパク質が細胞内に蓄積しています。従って、ｐ６２のＳ４０３リン酸化を促進することで選択的オートファジーを亢進することができれば、異常タンパク質を効率よく分解し疾患の治療につながることが期待できます。その可能性を探るため、研究グループは、ハンチントン病の病因遺伝子であるハンチンチンの一部を発現したモデル細胞において、ｐ６２のＳ４０３リン酸化を促進させた場合の異常ハンチンチンの蓄積の変化を調べました。その結果、ＣＫ２の過剰発現でＳ４０３リン酸化を促進させると、異常ハンチンチンの凝集体が顕著に減少し、またｐ６２の発現を抑えるとこの効果は抑制されることが分かりました（図４）。このことは、ｐ６２のＳ４０３リン酸化の促進により、細胞毒性を持つ異常タンパク質を選択的に除去できる可能性を示しています。

以上の結果から研究グループは、細胞内のｐ６２はリン酸化型と非リン酸化型が平衡状態で共存し、Ｓ４０３リン酸化型ｐ６２はプロテアソームで壊すことができないユビキチン化タンパク質と強く結合してｐ６２小体を形成し、選択的オートファジーで最終的に分解する「タンパク質の品質管理」の新たな制御メカニズムを提唱しました（図５）。

3．今後の期待

今回の結果から、ｐ６２のＳ４０３リン酸化を特異的に促進する薬剤を開発することができれば、選択的オートファジーを亢進させ異常タンパク質を効率よく分解できることが期待できます。ハンチントン病だけでなく、異常タンパク質の細胞内蓄積を特徴とするアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の治療への応用も期待できます。

＜補足説明＞

注１） ハンチントン病

主に中年以降に発症する常染色体優性遺伝の遺伝性慢性進行性の疾患。臨床症状は主に不随意運動で、知能障害、精神症状を伴う。１９８３年にハンチントン病遺伝子が第４染色体短腕に存在することが示され、１９９３年にその原因遺伝子（ハンチンチン遺伝子）が同定された。この原因遺伝子の一部の塩基配列に存在するＣＡＧ繰り返し配列が正常より長いために引き起こされる。ＣＡＧ繰り返し配列が翻訳されるとグルタミン鎖となり、正常より長くなったグルタミン鎖を病因にもつ疾患群をポリグルタミン病と呼ぶ。

注２） 細胞毒性

細胞内外に蓄積する異常タンパク質は細胞の機能を障害し死に至らしめる毒性を持つ。細胞内でも核内か細胞質に蓄積するかによってその毒性の機序は異なると考えられる。この異常タンパク質の蓄積を防ぐことにより、細胞毒性や神経の変性を抑えることが疾患の発症を予防するために必要である。

注３） プロテアソーム

細胞質や核内に分布しているタンパク質を分解する巨大な酵素複合体。ポリユビキチン鎖により標識された変性タンパク質を選択的に分解する。大きなタンパク質複合体や凝集したタンパク質などは分解できない。

注４） オートファジー

細胞が自らの細胞内成分を分解する主要メカニズム。細胞内のオルガネラや安定なタンパク質などの細胞質成分をオートファゴソーム（小胞）へとりこみ、リソソームで分解する。ｐ６２などの特定のタンパク質によって働くオートファジーを選択的オートファジーという。

注５） ユビキチン

ユビキチンは他のタンパク質の修飾に使われるタンパク質。タンパク質分解、ＤＮＡ修復、翻訳調節、シグナル伝達などさまざまな生命現象に関わる。ユビキチン化とはタンパク質修飾の一種で、ユビキチンリガーゼなどの働きによりユビキチンタンパク質が基質タンパク質に付加されること。ユビキチンが複数連なったポリユビキチン鎖の修飾を受けたタンパク質は、通常選択的にプロテアソームで分解される。

注６） ｐ６２小体

ｐ６２が形成する細胞内の顆粒構造体。脂質膜を持たないセクエストソームとｐ６２を含むオートファゴソーム、オートファゴソームがリソソームと融合したオートリソソームの異なる構造体の総称。それらすべての構造体の中にｐ６２が含まれるが、形態的にそれらを光学顕微鏡下で区別できないため、ｐ６２を含む顆粒構造全てを含む。

注７） 核内封入体

一般に光学顕微鏡で可視できるタンパク質凝集体を封入体という。アルツハイマー病における神経原線維変化、パーキンソン病のレビー小体などは細胞質封入体である。ポリグルタミン病は、疾患遺伝子産物の伸長ポリグルタミン（正常より長くなったグルタミン）を含むタンパク質が核内に蓄積し、核内封入体を形成することが特徴である。

＜参考図＞

＜原著論文情報＞

Gen Matsumoto, Koji Wada, Misako Okuno, Masaru Kurosawa, and Nobuyuki Nukina
“Serine 403 phosphorylation of p62/SQSTM1 regulates selective autophagic clearance of ubiquitinated proteins”　Molecular Cell　2011　doi: 10.1016/j.molcel.2011.07.039

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