転写因子Ｇｌｉｓ１により安全なｉＰＳ細胞の高効率作製に成功

＜ポイント＞

• 転写因子^注１）Ｇｌｉｓ１の導入によりマウス／ヒトｉＰＳ細胞の樹立効率が大幅に改善される。
• Ｇｌｉｓ１は、不完全に初期化された細胞の増殖を抑制し、完全に初期化されたｉＰＳ細胞のみを増殖促進させる。
• Ｇｌｉｓ１が初期化を促進する仕組みにも迫る。

１．要旨

前川 桃子　助教（京都大学 ウイルス研究所／同校 ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）／科学技術振興機構（ＪＳＴ） 「山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト」）と山中 伸弥　教授（京都大学 物質－細胞統合システム拠点（ｉＣｅＭＳ）／ＣｉＲＡ／ＪＳＴ 山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト）の研究グループは、五島 直樹　主任研究員（産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ） バイオメディシナル情報研究センター／新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ） ｉＰＳ細胞等幹細胞産業応用促進基盤技術開発）の研究グループとの共同研究で、卵細胞で強く発現する転写因子Ｇｌｉｓ１を用いると、従来の方法に比較して非常に効率よく人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）^注２）を誘導できることを発見しました。

従来は、レトロウイルスベクター^注３）で４つの転写因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）を線維芽細胞^注４）に導入してｉＰＳ細胞を作製していましたが、原がん遺伝子ｃ－Ｍｙｃによる腫瘍発生が懸念されていました。また、ｃ－Ｍｙｃなしでの誘導では、作製効率が低いこともあり、安全なｉＰＳ細胞を効率よく誘導する方法の開発が望まれていました。

本研究では、ｉＰＳ細胞誘導に関与する新規因子の探索を行い複数の因子を同定しましたが、そのうちのＧｌｉｓ１を３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）と一緒に、マウスまたはヒトの線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて導入したところ、いずれにおいてもｉＰＳ細胞の樹立効率が顕著に改善されました。さらに、Ｇｌｉｓ１は初期化が不完全な細胞の増殖を抑制し、完全に初期化した細胞のみ増殖することを明らかにしました。また、Ｇｌｉｓ１が初期化を促進する機構についても詳細な解析を行いました。今回発見された転写因子Ｇｌｉｓ１とそこから得られた知見は、将来の臨床応用に役立つことが期待されます。

本共同研究は、ＪＳＴ、ＮＥＤＯなど「８．本研究への支援」の機関が省庁の垣根を越えた連携のもとでの支援を受け実施されました。

この研究成果は、英国科学雑誌「Ｎａｔｕｒｅ」２０１１年６月９日（英国時間）号で公開されます。

２．研究の背景

山中教授の研究グループは、線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて、４つの転写因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）を導入してｉＰＳ細胞の作製に成功しています。しかし、導入したｃ－Ｍｙｃの影響と思われる腫瘍形成のリスクや、ｃ－ＭｙｃなしではｉＰＳ細胞の樹立効率が極端に低いことが示されています。

そこで、臨床応用に使用できるｉＰＳ細胞を効率よく作製する方法の確立のために、本研究グループは、より安全でより効率の良い新規初期化因子の探索を行ってきました。その過程で、五島主任研究員らがＮＥＤＯプロジェクトで構築してきたヒトｃＤＮＡ^注５）ライブラリー（ヒトたんぱく質発現リソース）から選出した１，４３７個の転写因子を用いて、Ｋｌｆ４の代替因子として新規に１８因子を同定しました。

いずれの因子もＫｌｆ４代替因子としての誘導効率は低かったのですが、その１８因子の１つである転写因子Ｇｌｉｓ１を、３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）あるいは４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）と一緒に、マウスやヒトの線維芽細胞に導入すると、非常に効率よくｉＰＳ細胞を作製できることを見出しました。さらに、Ｇｌｉｓ１が初期化を促進する機構を詳細に検討しました。

３．研究結果

１）Ｇｌｉｓ１の導入によりマウスおよびヒトｉＰＳ細胞の樹立効率改善

Ｇｌｉｓ１を３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）あるいは４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）と同時に、マウスやヒトの線維芽細胞に導入したところ、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）^注６）と同様の多能性マーカー遺伝子を発現し、形態も類似したｉＰＳ細胞を効率よく誘導することができました。

また、Ｇｌｉｓ１は、ｃ－Ｍｙｃによって誘導される初期化が不完全な細胞や形質転換された細胞の増殖を抑制していることがわかりました（図１、図２）。

Ｇｌｉｓ１と３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）で誘導したｉＰＳ細胞は、奇形腫^注７）を形成（三胚葉^注８）へ分化能を証明）し（図３）、また、ｉＰＳ細胞由来キメラマウス^注９）は生殖系譜にも寄与することがわかりました（図４）。さらに、Ｇｌｉｓ１から作製されたキメラマウスでは、ｃ－Ｍｙｃを用いて作製された場合のような顕著な腫瘍発生や短命化は認められませんでした。

２）Ｇｌｉｓ１の機能解析結果

• Ｇｌｉｓ１を含む転写因子をマウス胎仔線維芽細胞に導入し、５日後の初期化早期に遺伝子発現解析を行ったところ、Ｇｌｉｓ１は初期化誘導に寄与することが報告されている複数の遺伝子の発現を促進することがわかりました。
• Ｇｌｉｓ１はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４とたんぱく質レベルで相互作用していることを明らかにしました。
• Ｇｌｉｓ１はＥＳ細胞では発現レベルが低いことを確認しました。そこで、マウスＥＳ細胞にＧｌｉｓ１を強制発現したところ、ＥＳ細胞の増殖が抑制されました。このことから、ｉＰＳ細胞誘導過程において、細胞に導入された因子の発現が抑制されない初期化不完全細胞では、Ｇｌｉｓ１の発現が継続することにより、細胞の増殖が抑制されていることを示唆しています。言い換えれば、増殖している細胞は、完全に初期化されたｉＰＳ細胞であることを示しています。

４．まとめ

今回の研究から、未授精卵や受精卵１細胞期で高度に発現している転写因子Ｇｌｉｓ１を３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）と共に線維芽細胞に導入すると、従来の方法に比較して非常に効率よくｉＰＳ細胞を作製できることが明らかになりました。また、Ｇｌｉｓ１は初期化が不完全な細胞の増殖を抑制し、完全に初期化した細胞のみ増殖させることがわかりました。さらに、Ｇｌｉｓ１は初期化誘導に寄与することが報告されている複数の遺伝子の発現を上昇させることによって初期化を促進していることもわかりました。

これらの結果は、Ｇｌｉｓ１を用いることにより、安全性の高いｉＰＳ細胞を効率よく作製できる可能性を示しており、臨床応用に使用可能なｉＰＳ細胞作製方法の確立に大きく貢献することが期待されます。

５．参考図

６．用語解説

注１） 転写因子

たんぱく質合成は、ＤＮＡ上の遺伝子を鋳型にしてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写され、このｍＲＮＡが核外のリボソーム上で翻訳される過程で成り立っている。転写因子は、転写開始に関わる因子で、ＤＮＡに結合して働くものや因子間の相互作用によって機能するものがある。

注２） 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）

皮膚などの体細胞に特定因子を導入することにより作製される。胚性幹細胞（ＥＳ細胞、注６参照）のように無限に増え続ける能力と体のあらゆる組織細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である。

注３） レトロウイルスベクター

ベクターとは、細胞外から内部へ遺伝子を導入する際の「運び屋」を指す。ウイルス由来のベクターは、遺伝子導入効率の高さから盛んに開発されてきた。目的遺伝子をウイルスに組み込み、細胞に感染させることにより遺伝子を導入する。レトロウイルスベクターは、このウイルスベクターの１種類として確立されたもので、宿主の細胞に感染したあと、宿主のＤＮＡのなかに入り込み、自らのウイルスを増殖させる性質を利用するものである。

注４） 線維芽細胞

皮膚などから得られる細胞の１種。

注５） ｃＤＮＡ

相補的ＤＮＡとも言う。ゲノムＤＮＡは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの１つの塩基で構成されており、このＤＮＡの一部が遺伝子として働く。たんぱく質合成の際に遺伝子として働く部分だけをコピーしたｍＲＮＡの塩基配列情報を写し取った相補鎖ＤＮＡのこと。

注６） 胚性幹細胞（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）

受精後６・７日目の胚盤胞から細胞を取り出し、それを培養することによって作製される多能性幹細胞の１つで、あらゆる組織の細胞に分化することができる。しかし、作製には受精卵を破壊する必要があり、倫理的な問題がある。また、患者自身の細胞から作製することができないため、細胞移植に利用する際には、免疫拒絶の問題が指摘されている。

注７） 奇形腫

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を免疫不全マウスの皮下などに注射すると、腫瘍を形成する。この腫瘍はテラトーマと呼ばれ、様々な種類の組織が混在している。テラトーマを観察し、様々な組織に分化していることを確認することは、細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の１つである。

注８） 三胚葉

受精後の胚からできる細胞は、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分けられる。内胚葉は、その後消化器官や呼吸器官を形成する。中胚葉は骨、心筋、赤血球などに分化する。外胚葉は、神経や感覚器官を形成する。

注９） キメラマウス

２つ以上の異なった遺伝子型の細胞、あるいは異なった種の細胞から作られた１個の個体をキメラと言う。例えば、ＥＳ／ｉＰＳ細胞を初期胚に移植して作製したマウスのことをキメラマウスと言う。

７．論文名および著者名

“Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1”
doi: 10.1038/nature10106

Momoko Maekawa^1,2), Kei Yamaguchi³⁾, Tomonori Nakamura^1,4), Ran Shibukawa^1,2), Ikumi Kodanaka^1,2), Tomoko Ichisaka^1,4), Yoshifumi Kawamura³⁾, Hiromi Mochizuki³⁾, Naoki Goshima⁵⁾, Shinya Yamanaka^1,2,4,6)

1）ＣｉＲＡ、2）ＪＳＴ 「山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト」、3）ＪＢｉＣ、4）ｉＣｅＭＳ、5）ＡＩＳＴ バイオメディシナル情報研究センター、6）グラッドストーン研究所（サンフランシスコ）

８．本研究への支援

本研究は、下記機関より資金的支援を受け実施されました。

• ＪＳＴ 「山中ｉＰＳ細胞特別プロジェクト」
• ＮＥＤＯ 「タンパク質機能解析・活用プロジェクト」「化合物等を活用した生物システム制御基盤技術開発」「ｉＰＳ細胞等幹細胞産業応用促進基盤技術開発」
• 文部科学省（ＭＥＸＴ） 「再生医療の実現化プロジェクト」
• 内閣府（ＣＡＯ） 「最先端研究開発支援プログラム（ＦＩＲＳＴプログラム）」
• 独立行政法人 医薬基盤研究所（ＮＩＢＩＯ） 「保健医療分野における基礎研究推進事業」
• ＭＥＸＴ、独立行政法人 日本学術振興会（ＪＳＰＳ） 「科学研究費補助金」

＜お問い合わせ先＞

京都大学 ｉＰＳ細胞研究所　国際広報室
Tel：075-366-7005　Fax：075-366-7024
E-mail：