マクロピノサイトーシスによる細胞膜回収が、神経突起退縮を制御

＜本研究成果のポイント＞

• 反発性軸索誘導分子Ｓｅｍａ３Ａにより、マクロピノサイトーシスが誘導
• マクロピノサイトーシス誘導にはＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの減少が必要
• 神経回路形成機構の理解と神経再生法確立に貢献する、新たなターゲットを提示

１．背景

私たちの神経回路形成は、誘因性軸索誘導因子と反発性軸索誘導因子の組み合わせによって成り立っています。そのうち反発性軸索誘導因子は、神経突起先端にある成長円錐の退縮を引き起こすことで神経突起の伸長を止め、間違った神経細胞とのシナプス形成を阻害します。この成長円錐の退縮は、正常な神経回路形成のために極めて重要な役割を担っています。例えば、反発性軸索誘導分子の１つであるＳｅｍａ３Ａを欠損したマウスは、初期発生期の神経突起が間違った方向へ伸び続け、神経回路網が正常に形成されません。また、Ｓｅｍａ３Ａは脊髄損傷時にその発現が誘導され、神経再生を阻害することが分かっています。このため、脊髄損傷治療の面からも、この反発性軸索誘導因子による成長円錐の退縮の仕組みを解明することは重要とされています。しかしこれまで、成長円錐の退縮時の膜表面積の減少の制御にかかわる分子機構の実体は不明のままでした。

細胞膜を回収するシステムとしてエンドサイトーシス^注７）が知られています。２００８年に研究グループは、Ｓｅｍａ３Ａによって成長円錐でマクロピノサイトーシスが誘導されることを報告しました。マクロピノサイトーシスの特徴として、１）クラスリン非依存性の細胞膜回収のエンドサイトーシスであること、２）蛍光ラベルされた分子量１０万以上のデキストランを取り込むことで可視化できること、３）取り込まれた小胞は非常に大きいため、空胞（Ｖａｃｕｏｌｅ）とも呼ばれ、顕微鏡下でしばしば容易に観察できること、があげられます。近年マクロピノサイトーシスはあらゆる生命現象に深く関わることが示され、例えば、血管内腔形成、さまざまなウイルスの哺乳類細胞への侵入、プリオンの細胞への侵入、また、抗原提示細胞が抗原を飲み込む際も知られています。

２００８年の成果は、神経細胞でマクロピノサイトーシスが誘導されることを示した最初の報告でしたが、Ｓｅｍａ３Ａ誘導のマクロピノサイトーシスの生理的役割や分子機構は解明できていませんでした。Ｓｅｍａ３Ａによって取り込まれた空胞面積は、成長円錐の表面積と逆相関し、成長円錐の退縮とともに空胞は増えていきます。従って研究グループは、マクロピノサイトーシスが成長円錐の退縮に重要な役割を担っていると考え、マクロピノサイトーシスを特異的に阻害するＥＩＰＡを用いて解明することに取り組みました。

２．研究手法と研究成果

（1）ＥＩＰＡによるＳｅｍａ３Ａとボツリヌフ毒素の阻害

ニワトリの培養背根神経節の神経細胞の成長円錐は、Ｓｅｍａ３Ａにより退縮します。しかしＥＩＰＡの存在下では、Ｓｅｍａ３Ａによる成長円錐の退縮は抑制されました（図１）。デキストランの取り込みも同様に抑制されました。この結果は、Ｓｅｍａ３Ａによる成長円錐の退縮が、マクロピノサイトーシスによる細胞膜の大規模な回収によるものであることを示しています。

次に、成長円錐でマクロピノサイトーシスがどのように誘導されるかを調べるため、マクロピノサイトーシスを成長円錐で制御する分子の同定を試みました。まず、膜輸送分子であるＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂを切断する活性を持つボツリヌフ毒素（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１^注８））に着目しました。Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１は成長円錐を退縮させると同時に、空胞形成を誘導することが知られており、その空胞がマクロピノサイトーシスによる空胞と非常によく似ていることから、研究グループはＮｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１による空胞形成がマクロピノサイトーシスによるものと推測し、解析を行いました。その結果、デキストランがＮｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１による空胞に取り込まれることが分かりました（図２）。また、このＮｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１によるデキストランの取り込みと成長円錐の退縮は、ＥＩＰＡにより抑制されました。これらの結果は、Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１による空胞形成と成長円錐の退縮がマクロピノサイトーシスによるものであることを示しています。

（２）マクロピノサイトーシスの負の制御因子Ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの同定

Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１は成長円錐に局在するＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂを切断することで、空胞形成を誘導することが知られていました。従って、Ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの発現を減少させることで同様に、成長円錐の退縮とマクロピノサイトーシスの誘導が起きるか調べたところ、実際にそれらの現象を観察することができました（図３）。つまり、Ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ｂはマクロピノサイトーシスの負の制御因子であるとともに、マクロピノサイトーシスが成長円錐を退縮させることを示しています。

Ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの減少により誘導される成長円錐の退縮とマクロピノサイトーシスは、Ｓｅｍａ３Ａによるものと非常によく似ていたため、Ｓｅｍａ３ＡがＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの機能や発現を低下させている可能性が考えられました。興味深いことに、成長円錐のＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂのタンパク量は１０分間のＳｅｍａ３Ａ処理によって、減少することが分かりました（図４）。このようなＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの減少は、ほかの反発性軸索誘導分子ｅｐｈｒｉｎ－Ａ２^注９）でも観察できますが、アクチン繊維の脱重合を阻害する薬剤では観察できませんでした。これは、Ｓｅｍａ３ＡがＳｙｔａｘｉｎ１Ｂの発現を抑制することによって、マクロピノサイトーシスを誘導することを示しています。

逆にＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂを過剰発現させると、Ｓｅｍａ３Ａによる成長円錐の退縮とマクロピノサイトーシス誘導が抑制されることが分かりました（図５）。これによりＳｅｍａ３ＡがＳｙｎｔａｘｉｎ１Ｂの発現を減少させることでマクロピノサイトーシスを誘導し、その結果、成長円錐を退縮させていることが明らかとなりました。

３．今後の期待

これまでの研究では、成長円錐の退縮を決めるのはアクチンなどの骨格系タンパク質と考えられてきました。それに対し本研究は、成長円錐の退縮に「マクロピノサイトーシスによる大規模な細胞膜の回収」という新たな分子機構が働いていることを提唱するものです（図６）。Ｓｅｍａ３Ａは発生初期の神経回路網形成に重要であり、また、神経再生が著しく困難な脊髄損傷において、中枢神経系の神経再生を阻害する分子としても知られています。今回の成果は、Ｓｅｍａ３Ａがマクロピノサイトーシスによって成長円錐を退縮させている可能性を世界で初めて示した点で、大きな意義があります。今後、Ｓｅｍａ３Ａに依存的なマクロピノサイトーシスの分子機構をさらに詳しく解明することで、神経再生法の確立にも貢献することが期待できます。

＜参考図＞

＜補足説明＞

注１） マクロピノサイトーシス

エンドサイトーシスの１つ。特徴として、クラスリン非依存性、分子量１０万以上のデキストランなどでラベルされ、取り込まれる細胞膜が大きく、しばしば空胞として容易に顕微鏡下で観察できる（直径０．２μｍ～５μｍ）。マクロピノサイトーシス特異的阻害剤として、ナトリウム／プロトン交換体阻害剤のアミロライド、またはその誘導化合物、５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）が知られる。

注２） 成長円錐

発達期に標的細胞とシナプスを形成するために、神経細胞は神経突起を伸ばす。神経突起方向を決めている。

ニワトリ背根神経節神経細胞の神経突起の先端にある成長円錐

注３） シナプス

神経細胞同士の情報伝達に関わる構造。情報を伝える細胞と伝えられる細胞の間には約２０ｎｍのすき間がある。情報を伝える細胞はこのすき間に神経伝達物質を放出し、伝えられる細胞側の神経伝達物質受容体がそれを受けとることにより神経情報が伝わる。

注４） Ｓｅｍａ３Ａ

反発性軸索誘導分子の１つで、成長円錐を退縮させることで、神経突起の伸長を止め、間違った細胞とのシナプス結合を阻害する。

注５） アミロライド誘導体（ＥＩＰＡ）

マクロピノサイトーシスの阻害剤であるアミロライドの誘導体、５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライドの略。ナトリウム／プロトン交換体の阻害剤。

注６） Ｓｙｎｔａｘｉｎ１Ｂ

Ｓｙｎｔａｘｉｎ１にはアイソフォームが２つあり、１Ａと１Ｂが知られる。１Ａは非常によく研究されているアイソフォームで、膜輸送に関与する。１Ｂは１Ａに比べあまり解析が進んでいない。ニワトリ胚背根神経節の成長円錐では１Ｂが発現している。

注７） エンドサイトーシス

細胞は脂質二重膜（形質膜）によって細胞外と隔てられている。細胞外の物質や形質膜を細胞内へ取り込むことをエンドサイトーシスと呼ぶ。よく知られたエンドサイトーシスとしてクラスリン依存性のものがあり、直径が１００～１５０ｎｍの小胞を形成する。他に、カベオリン依存性のエンドサイトーシスは直径５０～８０ｎｍ、マクロピノサイトーシスは直径０．２μｍ～５μｍの小胞を形成する。

注８） Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｃ１

ボツリヌフ菌（学名：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）が作り出す毒素。亜鉛依存性のメタロプロテアーゼの１つで、非常に強い毒性を示す。基質として膜輸送に関わるｓｙｎｔａｘｉｎファミリーのうち、ｓｙｎｔａｘｉｎ１，２，３を切断することが分かっている。成熟神経シナプスの神経伝達物質の放出を抑制する。

注９） ｅｐｈｒｉｎ－Ａ２

反発性軸索誘導因子の１つ。

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御子柴 克彦（ミコシバ カツヒコ）
独立行政法人 理化学研究所 脳科学総合研究センター　発生神経生物研究チーム　チームリーダー

樺山 博之（カバヤマ ヒロユキ）
独立行政法人 理化学研究所 脳科学総合研究センター　発生神経生物研究チーム　研究員
Tel：048-467-9745　Fax：048-467-9744

納富 さより（ノウドミ サヨリ）
独立行政法人 理化学研究所　脳科学研究推進部
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