ＲＮＡアプタマーが標的分子を捕捉する仕組みを発見

＜研究の背景と経緯＞

ＲＮＡアプタマーは、たんぱく質などの標的分子に対して抗体のような高い親和性と高い特異性を有するＲＮＡ分子で、化学合成で大量合成が可能で改良も容易であるといった抗体にはない特徴を持っています。そのため医薬品や工業への応用が期待され、実用化に向けた研究が精力的に行われています。

しかし、ＲＮＡが「マイナス」の静電気を帯びているため「プラス」の静電気を帯びたたんぱく質しか標的にしにくいこと、また、たんぱく質とＲＮＡアプタマーの複合体の立体構造がほとんど解明されておらず、その作用機構が不明であることなどの課題も残されていました。従って、プラスの静電気をあまり帯びないたんぱく質と強く結合するＲＮＡアプタマーを開発し、かつ、その作用機構を明らかにすることができれば、新しいＲＮＡアプタマーをデザインし、その機能をコントロールすることが可能となると期待されていました。

東京大学医科学研究所の中村教授らは２００８年に、人間が持つ最も一般的な抗体で、プラスの静電気の部分が少ないＩｇＧのＦｃドメイン（ｈＦｃ）^注３）に結合するＲＮＡアプタマーの配列の特定に成功しています。このＲＮＡアプタマーには６番目のウラシル（Ｕ６）の２’フルオロ化の修飾^注４）が重要であること、ヒトＩｇＧに特異的に作用するが他種生物のＩｇＧには全く結合しないといった特徴があります（参考文献１）。また、抗体医薬の精製には抗体結合たんぱく質「プロテインＡ」を固定化したカラムが用いられていますが、中村教授らが取得したＲＮＡアプタマーはプロテインＡに代わることができます。プロテインＡのカラムを用いた場合、酸性条件にすることによって抗体を溶出していますが、このアプタマーを用いると中性条件で二価の陽イオンを除くことでＩｇＧを溶出することができ、抗体医薬品の精製において非常に有利です。

さらに本研究グループは２００８年に、新しい結晶化技術を駆使してｈＦｃとＲＮＡアプタマーの複合体の高品質な結晶を得ることにも成功しています（参考文献２）。

＜研究の内容＞

本研究グループは今回、Ｘ線結晶構造解析法を用いて２００８年に得たｈＦｃとＲＮＡアプタマーの複合体の高品質な結晶の立体構造解析を行い、高解像度（２．１５Å分解能）で立体構造を明らかにしました。ＲＮＡアプタマーはｈＦｃに２つ結合しており（図１）、以下のことが分かりました。

ＲＮＡアプタマーがｈＦｃとプラスとマイナスではない力で相互作用できる。

一般に、ＲＮＡはマイナスに帯電しているためプラスに帯電しているたんぱく質表面に結合します（図２右）。本研究チームは今回、ＲＮＡアプタマーがプラスに帯電していないｈＦｃの表面に結合できることを見いだしました（図２左）。このたんぱく質は結合前と結合後でその構造をほとんど変化させなかったことから（図３）、ＲＮＡアプタマーがたんぱく質の表面の形に沿った構造を作り出し、強い結合力を発揮することが示されました。この“ＲＮＡのしなやかな造形力”を利用すれば、新たな分子標的医薬品（アプタマー医薬品）が開発できます。

ＲＮＡアプタマーのｈＦｃとの相互作用をコントロールできる。

カルシウムイオンがこのＲＮＡアプタマーに結合することが分かりました。カルシウムイオンは、ＲＮＡアプタマーの深い溝に結合し（図１）、アプタマーの立体構造を保持していました。そこでカルシウムイオンを人為的に添加・除去したところ、ＲＮＡアプタマーとｈＦｃとの結合が見事にコントロールできることが分かりました（図４）。

また本研究から、ＲＮＡアプタマーのＵ６に２’フルオロ化により付加されたフッ素原子（２’Ｆ）がＲＮＡアプタマーの７番目のグアニジン（Ｇ７）の水素原子（Ｈ８）と相互作用すること、またこちらもＲＮＡアプタマーの構造形成に重要であることが分かりました（図５）。Ｕ６の２’Ｆを違う原子に変えるだけで結合しないことも確認できました。

このように、ＲＮＡアプタマーの結合を簡便にコントロールできる技術が開発されたことにより今後、ＲＮＡアプタマーの医薬品だけでなく抗体精製などの工業的な利用も期待できます。

ＲＮＡアプタマーは、ヒトＩｇＧに特徴的なアミノ酸を認識することで非常に高い特異性を得ている。

ＲＮＡアプタマーとｈＦｃの複合体の構造解析から、ＲＮＡアプタマーはｈＦｃの３４２番目のグルタミン酸（Ｑ３４２）の周りを取り囲むように結合していることが分かりました（図６）。Ｑ３４２はヒトＩｇＧに特徴的なアミノ酸であることから、ＲＮＡアプタマーはこの１つのアミノ酸であるＱ３４２を認識することで非常に高い特異性を得ていることが分かりました（図７）。このように、非常に微小な部分（１つのアミノ酸）を特異的に認識することは抗体では困難であると予想され、この特徴を生かせば標的特異性の高い新たなアプタマー医薬品の開発につながるものと期待されます。

本研究で用いたアプタマーの標的分子であるｈＦｃは、もともとＲＮＡ結合たんぱく質ではありません。このように、たんぱく質に結合することができるＲＮＡアプタマーの重要な作用機構の詳細を解明したのは世界で初めてのことで、ＲＮＡの新たな可能性を切り開くものです。また、人工ＲＮＡである２’Ｆ修飾ＲＮＡとたんぱく質の複合体の解析も世界で初めての結果で、インパクトの高いものです。

＜今後の展開＞

本研究では、ヒトＩｇＧに特異的に結合するＲＮＡアプタマーとヒトＩｇＧの複合体の詳細な構造を解明し、そのＲＮＡアプタマーがたんぱく質を捕らえる新しい仕組みを明らかにしました。さらに、カルシウムイオンを用いたＲＮＡアプタマーの結合のコントロールにも成功しました。このアプタマーを使うことでヒト化抗体やｈＦｃ融合たんぱく質を中性で精製することが可能になり、プロテインＡに代わって今までよりも簡単な方法で抗体医薬品精製を行えるようになります。また、本研究のような新しいたんぱく質とＲＮＡの相互作用の基盤とその機能コントロール技術は、次世代医薬品であるＲＮＡアプタマー医薬品の開発に直接利用できます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） Ｘ線結晶構造解析

結晶化した分子の三次元構造をＸ線の回折を利用して詳細に観察することができる実験的な手法の１つ。たんぱく質などの結晶にＸ線を照射すると多数のさまざまな大きさの斑点からなる回折像が形成されますが、この回折像の斑点の位置や大きさから結晶内の原子や分子の位置が計算できます。この方法で分子を詳細に観察するためには、その分子からなる高品質結晶が必要ですが、特に今回のようなたんぱく質とＲＮＡとの複合体の場合には高品質結晶の作製が困難で、Ｘ線結晶構造解析におけるボトルネックとなっています。

注２） ＲＮＡアプタマー医薬

近年、ＲＮＡアプタマー医薬は抗体医薬に代わる次世代医薬として注目されています。すでに海外では加齢黄斑変性症の治療薬が上市されており、数種類が臨床試験中です。

注３） Ｆｃドメイン（ｈＦｃ）

ヒトＩｇＧには、さまざまな抗原を認識するための変化に富んだ可変領域と、常に変わらない定常領域とがあります。この定常領域の一部がＦｃドメインです。抗体医薬品に使われるキメラ抗体やヒト化抗体では定常領域をヒトのものにしています。

注４） ２’フルオロ化の修飾

核酸医薬を生体内で活性を発現させるために、ＲＮＡのリボースの２’部位にフルオロ化（２’Ｆ）して生体内の分解酵素に対する耐性を持たせる必要があります。このように修飾されたアプタマーは、生体内での天然のＲＮＡの１０,０００倍以上安定性が向上します。

＜論文名＞

“Conformational plasticity of RNA for target recognition as revealed by the 2.15Å crystal structure of a human IgG-aptamer complex”
（２．１５Å分解能のヒトＩｇＧ－アプタマー複合体結晶構造により明らかとなったターゲット認識のためのＲＮＡの構造可塑性）
doi: 10.1093/nar/gkq615

＜参考文献＞

１．Structural and molecular basis for hyperspecificity of RNA aptamer to human immunoglobulin G
RNA 14 1154-1163 (2008)

２．Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of an RNA aptamer in complex with the human IgG Fc fragment
Acta Cryst. F64, 942-944 (2008)

＜お問い合わせ先＞

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松村 浩由（マツムラ ヒロヨシ）
大阪大学 大学院工学研究科　准教授
〒565-0871 大阪府吹田市山田丘２－１
Tel：06-6879-7410　Fax：06-6879-7409
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中村 義一（ナカムラ ヨシカズ）
東京大学医科学研究所　基礎医科学部門　教授
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