大脳新皮質に新しい神経前駆細胞を発見

＜研究の背景と経緯＞

大人の脳は、非常に再生しにくいことが昔からよく知られています。そのため、事故や疾病による脳の損傷により、多くの人たちが後遺症を抱えたまま一生を過ごさなければならず、患者のＱＯＬ（生活の質）の低下や家族の負担も甚大なものとなっており、一刻も早い治療法の確立が望まれています。

一方、近年になり、大人の脳でも新しい神経細胞が盛んに作られることが、記憶に関連する海馬の歯状回や、においの感覚を伝える嗅球の神経細胞が作られる側脳室の脳室下帯で明らかになっています。これらの領域に存在する神経細胞の元になる神経幹細胞^注２）や前駆細胞を利用して、体外で増殖・分化させた後に損傷した脳の領域に移植する方法を開発する試みが行われています。また、再生医療で注目されている人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた脳・神経系の治療法開発の試みも同じ論理に基づいています。しかし、損傷部位に存在する神経細胞の種類は多岐にわたるため、幹細胞から目的の神経細胞だけに分化させることが困難です。増殖細胞の移植によるがん化などの問題もあり、体外からの細胞移植による脳損傷・疾患の治療法は、まだ開発途上にあるのが現状です。

脳損傷に対する治療法のもう１つの柱と考えられているのは、もともと脳内に存在する神経幹細胞や前駆細胞を利用して、体内に存在したまま増殖・分化させる治療法です。この治療法を確立するためには、対象となる脳の領域に存在する神経幹細胞や前駆細胞を同定することが必須となります。最近の研究により、損傷によって大脳新皮質における神経細胞の新生が報告されており、脳内に大脳新皮質の神経細胞を産生する神経幹細胞や前駆細胞が存在するのではないかと推測されていました。しかし、成熟期の大脳新皮質の神経幹細胞や前駆細胞が、どこに存在し、どのような性質を有しているのか、これまで全く明らかにされていませんでした。

また大脳新皮質は、認識、思考、意識など脳の高次機能の中心であり、大人の大脳新皮質でも神経細胞が作られるかどうかは１００年以上前から議論の続く重要な問題ですが、はっきりとした証明はされていませんでした。従って、大人の大脳新皮質において神経幹細胞や前駆細胞を同定することは、基礎科学と臨床医学にとって非常に重要なことになります。

＜研究の内容＞

本研究グループは今回、成熟したラットの大脳新皮質の表層（第１層）に神経細胞を生み出す神経前駆細胞（Ｌ１－ＩＮＰ細胞）を発見しました。さらに、Ｌ１－ＩＮＰ細胞は、前脳虚血を起こすと盛んに分裂し、抑制性神経細胞を産生しました。また、ラットの行動実験で、新しく作られた抑制性神経細胞が神経回路に組み込まれていることを明らかにしました。以下、それぞれの項目について詳述します。

１）大脳新皮質第１層の分裂細胞

まず、細胞分裂マーカーであるＫｉ６７の全脳マッピングを行った結果、大脳新皮質第１層にＫｉ６７陽性細胞が集積していることを見いだしました。さらに、多種の細胞マーカーとの多重免疫染色により、第１層分裂細胞は、抑制性神経伝達であるＧＡＢＡを合成する酵素であるＧＡＤ６７を含有していることを明らかにしました。ＧＡＤ６７は、海馬と脳室下帯の神経幹細胞や前駆細胞にも発現しているため、第１層分裂細胞に注目しました。

２）レトロウイルスを利用した第１層分裂細胞の解析

第１層分裂細胞と分裂して生まれた新生細胞の形態を詳細に解析できるように、膜移行性緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）を発現するレトロウイルスベクター^注７）を作製しました。このレトロウイルスベクターを第１層分裂細胞に感染させて多重免疫染色を行い、第１層分裂細胞が球型の細胞で２、３本の短い突起を持っていることを明らかにしました。また、軽度な脳虚血を起こすと第１層分裂細胞は盛んに増殖することが分かりました（図１）。

３）新生細胞についての解析

第１層分裂細胞から生まれた新生細胞の移動について時間を追って解析すると、第１層から深層（第６層）へ７～１０日で到達することが明らかになりました（図２）。新生細胞は、ほぼ全て一様の形態学的な特徴を示し（図３）、新生細胞を多重免疫染色すると、約８０％は、ＧＡＢＡ陽性の抑制性神経細胞に分化することを見いだしました（表１）。その他に、新しく産生された神経細胞は、ニューロペプチドＹ^注８）（約３０～４０％）、ソマトスタチン^注８）（約１０％）などを発現していることが分かりました。また、グリア細胞のマーカーを使用して多重免疫染色を行いましたが、新生細胞は全く染色されませんでした。この結果、新生したのは神経細胞で、グリア細胞の新生はないと言えます。新生神経細胞の神経回路への組み込みについて解析するために、ラットの新規探索行動課題^注９）を利用しました。探索行動によって活動した神経細胞は、神経興奮のマーカーであるｃ-Ｆｏｓを発現しますので、ＧＦＰとｃ-Ｆｏｓを共に発現している細胞は、回路に組み込まれている新生細胞と言うことができます。ウイルスベクター感染後、虚血を起こして神経細胞新生を誘導し、さらに１ヵ月経過したラットを回転車やトンネルを入れて環境を豊かにした新しいケージに移し、新規探索行動をさせると、大脳新皮質内にＧＦＰとｃ-Ｆｏｓを共に発現している細胞が出現しました。この結果は、新しく生まれた神経細胞が脳の神経回路に組み込みまれていることを示唆しています。

以上の結果から、大脳新皮質第１層に神経前駆細胞（Ｌ１－ＩＮＰ細胞）が存在することを世界で初めて実証しました。（図４）。

＜今後の展開＞

新生神経細胞に含有されているニューロペプチドＹとソマトスタチンには、神経細胞の活動を抑制することにより、神経回路の異常な電気的興奮状態であるてんかんを抑える機能があります。今回、新生神経細胞の８０％がＧＡＢＡ作動性であったことから、Ｌ１－ＩＮＰ細胞の増殖・分化、新生神経細胞の生存を薬剤などで制御することができれば、脳卒中が原因で起こるてんかんやそれに付随する認知機能の低下を防ぐ治療法の開発につながることが期待されます。

また、統合失調症などの精神疾患では、大脳新皮質において、抑制性神経細胞の数が有意に低下する中間表現型が知られていますが、抑制性神経細胞を増殖・維持させることができれば、精神疾患に対する新しい“細胞治療法”に結びつく可能性もあります。

＜付記＞

本研究は、京都大学 大学院医学研究科の金子 武嗣　教授、東京農工大学 工学府の中村 俊　教授らと共同で行われました。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） 大脳新皮質

大脳新皮質は、認識、運動、思考、記憶、意識などの脳高次機能と密接に関連しており、ほ乳類になってから非常に発達した薄いシート状の構造で、脳の表面に位置しています。大脳新皮質は、垂直方向に、細胞構築によって区別される６層構造を持っています（本研究で用いたラットの大脳新皮質は、約２ｍｍの厚さです）。また、水平方向も細胞構築が異なる領域が存在していて、感覚、運動、言語、認知などの機能がそれぞれの領域に局在しています（これを機能局在と言います）。

注２） 神経前駆細胞、神経幹細胞

神経幹細胞は、未分化な性状を保ったまま増殖できる自己複製能と、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することができる多分化能の両方を有しています。神経幹細胞からは、自己複製能を持つ少し分化した前駆細胞が分裂してきます。神経前駆細胞からは神経細胞、グリア前駆細胞からはグリア細胞が生み出されます。つまり、神経幹細胞＞神経前駆細胞＞神経細胞、あるいは神経幹細胞＞グリア前駆細胞＞グリア細胞、という脳内の細胞について分化経路が存在します。

注３） 神経新生

脳の中には、１，０００億個のニューロン（神経細胞）と、その１０倍の数のグリア細胞（神経膠細胞）が存在し、精密なネットワークを形成しています。ネットワーク構築のためには、脳の細胞の元になる細胞（神経幹細胞）が多数分裂して数を増やし、ニューロンやグリアの細胞に分化することが必要です。この過程を「神経新生」（もしくはニューロン新生）と呼んでいます。

注４） 虚血（脳虚血）

脳卒中（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血）や脳の外傷、一過性心肺機能停止後の蘇生により、脳の一部または全体が、一過性にあるいは永久的に血液が脳に行き渡らない状態のことを虚血といいます。虚血状態になると、脳のエネルギー源であるグルコースや酸素の供給が絶たれてしまうために、その領域の神経細胞の生存が維持できなくなり死滅します。

注５） 抑制性神経細胞

神経細胞の活動電位の発生を抑制する神経細胞を指します。中枢神経系を構成する神経細胞の約２０～３０％を占めています。この細胞は、刺激を受けて興奮すると、神経伝達物資として、ＧＡＢＡあるいはグリシンを放出します。中枢神経系のシナプスの約３０％がＧＡＢＡ伝達性です。一方、グリシンは、脳幹と脊髄で主要な抑制性伝達物質です。

注６） 中間表現型

精神医学の概念の１つで、遺伝的に規定される要因の大きい生物学的特徴を指し、遺伝子と表現型の間に位置づけられます。精神疾患は、診断の決め手となる生物学的な検査はほとんどなく、既往歴や症状を、医師が患者さんとの会話などを通して総合的に評価して診断します。最近になり、生物学的な指標である中間表現型をもって診断する試みが行われるようになってきました。たとえば、統合失調症の中間表現型として、作業記憶の障害などがあります。

注７） レトロウイルスベクター

レトロウイルスはＲＮＡウイルスの一種で、細胞に侵入後、遺伝子ＲＮＡがウイルス粒子内の逆転写酵素によって一度ＤＮＡに逆転写されて、ウイルス由来の遺伝子が細胞の染色体に組み込まれる生活史を持っています。また、レトロウイルスの重要な特徴として、分裂細胞に特異的に感染することが挙げられます。今回の研究では、レトロウイルスの自己増殖能や病原・感染性をコードする遺伝子を取り除いた安全性の高いレトロウイルスベクターを用いて、発現させたい遺伝子（ＧＦＰ）を組み込み、それをラットの脳内に導入して分裂細胞に発現させました。

注８） ニューロペプチドＹ、ソマトスタチン

ニューロペプチドＹとは、神経ペプチドの１つで、視床下部においては摂食行動やエネルギー調節に関係しています。また、大脳新皮質をはじめ脳内に豊富に発現しており、不安、鬱、てんかんなどへの関係が示唆されています。

ソマトスタチンも神経ペプチドの１つで、脳内に広く分布しています。脳下垂体における成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモンの分泌抑制をはじめ、アルツハイマー病や精神疾患患者の大脳新皮質で顕著に減少していることから、脳の高次機能にも関係しています。

注９） 新規探索行動課題

げっ歯類には、新しい環境下に置かれたときに、盛んにその環境がどのようなものであるのか、五感を使って探索する性質があります。その性質を利用して、動物が新しい環境に置かれたときに示す探索行動を指標にした課題のことです。本研究では、新規探索行動課題後に、ヒゲの感覚が大脳新皮質に入力する部位である体性感覚野で新生した神経細胞の免疫染色を行っています。

＜論文名＞

“Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells”
（大脳新皮質第１層分裂細胞による虚血依存的な神経新生）
doi: 10.1038/nn.2473

＜お問い合わせ先＞

＜研究に関すること＞

大平 耕司（オオヒラ コウジ）
藤田保健衛生大学 総合医科学研究所　システム医科学研究部門　助教
〒470-1192 愛知県豊明市沓掛町田楽ヶ窪１－９８
Tel：0562-93-9383　Fax：0562-92-5382
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