バクテリオロドプシンは光の照射によりその分子構造が変化（光異性化）しますが、その反応は超高速であるため、遷移状態を実反応時間で観測することは難しいとされてきました。
本研究グループは、超短レーザーパルス発生装置と多波長同時検出装置を組み合わせることにより、実反応時間での分子振動スペクトルの測定を可能にしました。このスペクトルは分子および電子の状態を反映しており、これらを解析することにより分子がどのような構造状態にあるかが明らかになります。本研究ではこの技術を複雑な生体高分子に適用し、膜たんぱく質バクテリオロドプシンの光異性化過程において、遷移状態にある分子の振動スペクトルを観察することに成功しました。このスペクトル解析により、バクテリオロドプシンの光異性化の初期過程においては、最初にレチナール注３）分子のＣ＝Ｎ結合の変形が引き起こされ、その後のＣ＝Ｃ結合長の変化により分子の一部が回転することで異性化することが判明しました。
光異性化のような分子の超高速の構造変化をリアルタイムで追跡することを可能にした今回の成果は、これまで解析が難しかった多くの現象解明につながり、医学や生物科学の分野に役立つことが期待されます。また、通信などの分野では新たな高速光デバイス材料の発見と応用加速にも貢献するものと思われます。
本研究は、台湾交通大学の籔下 篤史 准教授と共同で行ったものです。
本研究成果は、２００９年２月１５日（米国東部時間）発行の米国科学雑誌「Biophysical Journal」に掲載されます。
戦略的創造研究推進事業
ICORP型研究
| プロジェクト名 | ： | 「超短パルスレーザープロジェクト」 |
| 研究総括 | ： | 小林 孝嘉（電気通信大学 大学院電気通信学研究科 特任教授） Ferenc Krausz（マックス・プランク量子光学研究所 ディレクター） |
| 研究期間 | ： | 平成１８年３月～平成２３年３月 |
＜研究の背景と経緯＞
１．遷移状態分光
分子の遷移状態を観察する方法としては、分子を極低温状態にすることで反応を低速化して分子振動の観察を行う方法が主流ですが、本研究グループの小林らは、高速の反応をそのまま観察する「遷移状態分光（図１）」を提唱してきました。
遷移状態分光において分子の振動を振動周期の数分の一以下で測定するためには、５フェムト秒注４）以下の超短パルスと、広帯域の波長が同時に計測できる検出器が必要となります。小林らはこれまでに、スペクトルの成分波長ごとに強度が極端に変化せず、なめらかで広帯域（４７０～８００ｎｍの波長領域）なスペクトルを持つ３．９ｆｓの超短パルスを発生できるＮＯＰＡ光学系注５）と１２８個の波長を同時に測定できる１２８チャンネル検出システムの開発に成功しています。
２．バクテリオロドプシン
バクテリオロドプシンは、バクテリアの細胞膜において水素イオン（プロトン）を細胞の内外へ出し入れするプロトン輸送に関わる生体膜たんぱく質です。バクテリオロドプシンにある波長の光が照射されると、たんぱく質中のレチナール分子がトランス型からシス型へと変形（図２）し、これがレチナールの周辺を取り囲むたんぱく質の構造変化を引き起こして、プロトンの輸送につながります。バクテリオロドプシンのこの光反応の初期過程は、生物の網膜にあるロドプシンと同様であることが知られています。
ロドプシンの光反応は数個の光子を検出できる人間の眼の視覚機構の根本を担う反応であり、その反応過程を解明することはとても重要です。しかし、ロドプシンは非常に脆く強い光を照射すると容易に壊れてしまうため、超短レーザーパルスを使用した時間分解分光解析を行うことは困難でした。一方、バクテリオロドプシンはとても丈夫な物質であり、一度光を当てても分解せずに元の状態に容易に再生するため、ロドプシンの光反応のモデル物質としてよく研究されているとともに、超高速光異性化による光に対する応答性の変化を利用した超高速光デバイスの材料として、光メモリーやスイッチなどへの応用も期待されています。
バクテリオロドプシンが光励起注６）された後の異性化の初期過程については、実験的・理論的に幅広く研究されいくつかの説が示されていますが、未だに確定的な結論が得られていませんでした。
＜研究の内容＞
バクテリオロドプシンの光異性化は超高速の反応であり、これまで遷移状態の実時間での測定は不可能とも考えられ、また実際できていませんでした。本研究グループは今回、ＮＯＰＡ光学系を用いた超短レーザーパルスと１２８チャンネル検出システムを組み合わせることにより、バクテリオロドプシンの光異性化における最初期過程の実時間観測に成功しました。
まず、バクテリオロドプシンの光異性化過程において、波長と時間による二次元時間分解スペクトルを測定しました。波長軸では５０５～６６４ｎｍの範囲の１２８データ点、時間軸ではマイナス１００～８００フェムト秒まで１フェムト秒ごとに９００データ点の波長スペクトルを測定し、実時間分子振動を観測しました。４つの特徴的なスペクトル領域は、分子がそれぞれ４つの異なる電子状態であることを示し、光励起されたバクテリオロドプシンの振動モードのダイナミクスが明瞭に視覚化されました（図３）。
次に、超短パルスレーザーで試料を瞬間的に光照射し、準連続的に光吸収を測定しました。この結果、１フェムト秒ごとにそのスペクトルが変化する様子が観測され、吸収ピークエネルギー・強度の変化から極めて高速に分子構造変化が時々刻々起きている現象が観測されました（図４）。また、分子振動周波数の解析では、特に光励起直後においてＣ＝Ｎ結合に特徴的な１６００ｃｍ-1の信号が観測されることから、このＣ＝Ｎ結合が光励起直後に変形を始めることが明らかになりました。さらに、分子振動（瞬時）周波数と既に確立している実験式との対比から、光異性化過程における分子構造の変化で、分子結合の結合長が時々刻々と変化する様子も鮮明になりました（図５）。
これらの結果から、バクテリオロドプシンの光励起状態においてはたんぱく質中のレチナール分子のＣ＝Ｎ結合で最初の配置変化が生じ、次にＣ＝Ｃ伸縮周波数が変化しＣ＝Ｃ結合周囲でのひずみが生じて異性化につながることが分かりました。これまで長い間、光励起後最初に起きる過程はＣ＝Ｃ結合の変形であると考えられてきましたが、本研究により、Ｃ＝Ｎ結合の変形が先行して起きていることが示されました。これは、Ｃ＝Ｃ結合の変形を妨げる人工分子を結合したロドプシン様のたんぱく質が、天然ロドプシンと同様な初期スペクトル変化を示すという不可思議を完全に説明し得る実験結果です。
バクテリオロドプシンの遷移過程の解明により、ロドプシンの光反応解明につながるとともに、バクテリオロドプシンの超高速全光スイッチなどの超高速光デバイス材料としての応用加速が期待されます。
＜今後の展開＞
超短レーザーパルス発生装置と多波長同時検出装置の組み合わせにより、フェムト秒の単位で生じるたんぱく質の構造変化の実時間測定と解析が可能となりました。
実時間振動分光法の発展は、生体高分子における分子構造変化をリアルタイムで追跡することを可能にし、これまで解析が難しかった多くの現象が明らかになると考えられます。例えば、化学反応や光誘起相転移における瞬間、瞬間の分子構造の全貌が明らかになり、光学的プローブが重要となる医療や生物科学の分野への発展が期待されます。
また、本測定技術を用いることにより、新しい非線型光学材料（光の照射により性質が変化する特性を持った材料）の探索・解析が進められ、光通信の分野においては超高速の光信号を処理するための超高速全光スイッチの実現につながることも期待されます。
＜参考図＞
図１ 遷移状態分光法
図２ バクテリオロドプシン中のレチナール分子の異性化模式図（トランス型→シス型）
紫色は炭素原子（Ｃ）、青色は窒素原子（Ｎ）を表します。
図３ 広帯域時間分解過渡吸収スペクトルの２次元図（遅延時間―プローブ波長）
図４ １フェムト秒ごとの時間分解過程吸収スペクトル
図５ バクテリオロドプシン光構造異性化のダイナミクス
＜用語解説＞
注１） 遷移状態
分子の構造変化における反応過程において、反応途中のエネルギーの高い、分子構造が変わりつつある状態のこと。フェムト秒（１０のマイナス１５乗秒）という短時間で起こる反応であることが多いため、直接的な観測はこれまでほとんど成されていなかった。
注２） 分子振動スペクトル
分子中の原子同士の距離や角度の変化（分子振動）の変化量を光の周波数の分布パターンで示したもの。振動の仕方によって、伸縮振動モード（距離変化）や変角振動モード（角度変化）などがあり、モードごとに特徴的な周波数の位置にピークとして現れることから、分子がどのような構造を持っているかを与える重要な情報となる。
注３） レチナール
色素たんぱく質の一種であるバクテリオロドプシンやロドプシンの中で、光のエネルギーを吸収する機能をもつ色素分子のこと。オプシンと呼ばれるたんぱく質部分と化学結合している。
注４） フェムト秒
１０のマイナス１５乗秒のこと。
注５）ＮＯＰＡ（Non-collinear Optical Parametric Amplifier：非共直線光パラメトリック増幅）光学系
フェムト秒オーダーのパルス幅を有する超短パルス光を発生させるための光学系。励起光と信号光を非同軸角で入射することにより、広帯域な超短パルスの発生を可能とする。
注６）光励起
光の照射によって電子が光エネルギーを受け取り、分子や原子でエネルギーの高い電子励起状態が引き起こされること。
＜論文名＞
“Primary conformation change in bacteriorhodopsin on photo-excitation”
（バクテリオロドプシンの光励起における初期構造変化）
＜お問い合わせ先＞
小林 孝嘉（コバヤシ タカヨシ）
電気通信大学 大学院電気通信学研究科 量子・物質工学専攻
レーザー新世代研究センター 特任教授
〒182-8585 京都調布市調布ヶ丘１－５－１
Tel：042-443-5845 Fax：042-443-5825
E-mail：
小林 正（コバヤシ タダシ）
科学技術振興機構 戦略的創造事業本部 研究プロジェクト推進部
〒102-0075 東京都千代田区三番町５ 三番町ビル
Tel：03-3512-3528 Fax：03-3222-2068
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