酸化ストレス状態を認識する分子を細胞の小胞体内で発見

本研究成果のポイント

• 酸化ストレスを認識するタンパク質ＥＲｐ４４が細胞内のIP₃Rを介したカルシウム情報伝達を直接に制御
• 細胞内での酸化還元（レドックス）状態の制御とカルシウム情報伝達が深く関連
• 老化現象の関わりなど医学・健康科学への貢献が期待

１．背景

　地球上の生物は、絶えず活性酸素種や様々なストレスによって生み出される酸化ストレスの危険に曝されています。しかし、長い進化の過程で、生物は、生体内の酸化還元（レドックス）状態を制御するレドックス制御機構を発達させることで、それらのストレスに対応し、生体内の恒常性を維持することに成功してきました。更に近年、酸化ストレスが細胞の障害になるだけではなく、情報伝達のセカンドメッセンジャー（※１）となり、細胞の機能を調節していることが解明されました。酸化ストレスとレドックス制御は、チオレドキシン（※２）等のタンパク質が中心的役割を担っており、タンパク質（システイン残基）中のチオール基のレドックス状態を制御することで、情報伝達のon/off の調節を行っています。（図１）
　生物の細胞は、細胞外からの刺激を受けるとそれらを様々な情報に変換し、細胞応答を引き起こします。細胞には、細胞内のカルシウム濃度を変化させることによって情報を伝達するカルシウムシグナル伝達機構が存在しています。カルシウムは、細胞内においてイオンとして存在するため、迅速かつ広範囲にわたる濃度変化つまり空間移動が可能です。その結果、多彩な情報伝達が生み出され、細胞分裂、細胞死、受精、発生等の様々な細胞応答の制御が可能となります。
　通常、細胞内のカルシウム濃度は、極めて低く抑えられており、細胞内カルシウム濃度上昇とその変動は、細胞内小器官である小胞体からのカルシウムの放出に依存しています。細胞質へのカルシウム放出は、細胞内の小胞体に局在するカルシウムの受容体であるIP₃R（アイピースリーレセプター）を介して行われています。IP₃Rは、ホルモンや神経伝達物質等の細胞外刺激によって細胞内に産生されるIP₃の結合によって活性化され、カルシウムを小胞体内腔から細胞質へ放出します。様々な種の生物に普遍的に存在するIP₃Rは、細胞分裂、細胞増殖、細胞死、受精、発生、記憶や学習といった多岐に渡る生命現象において重要な役割を果たしていることが知られています。（図２）
　IP₃Rは分子量３００kDa（※３）に及ぶ巨大なタンパク質であり、４量体（※４）を形成することでチャネルとして機能します。また、IP₃RにはIP₃R1・IP₃R2・IP₃ R3 の３種のサブタイプが存在します。それらの細胞内局在や組織分布は必ずしも同じではなく、それ故にそれぞれのサブタイプが特有の役割を生体内で果たしていると考えられています。その構造の大部分は細胞質に存在、そこにはIP₃結合領域が存在しており、今まで多くの研究者が細胞質領域に焦点を当てることによって、カルシウム制御機構を解明できると考えていました。
　しかし、どのようにしてIP₃Rを介した時空間的カルシウム濃度が精密にかつ微細に制御されているかについて、未だ不明な点が多く残されています。

２．研究手法と成果

　今回、研究グループは意外な側面からIP₃Rの制御が全く新しい機構によって行われていることを発見しました。IP₃Rには細胞質領域の他、小胞体膜を貫通する部位とその結果生じる小胞体内腔領域(L3)も存在します。重要な特徴は、チャネルポアというカルシウムが小胞体膜を通過する際に通る入り口が小胞体内腔領域によって形成されていることです。研究グループは、このポア領域に隣接する小胞体内腔領域に注目しました。興味深いことに、L3 の中でもポア領域(L3C)ではサブタイプ間でアミノ酸配列が完全に保存されているのに反し、その隣接領域(L3V)では非常に低い相同性を有していました。
　そこで、研究グループはL3Vに結合するタンパク質がIP₃Rの活性を制御し、その制御はサブタイプ特異的である考え、結合タンパク質を検索しました。その結果、酸性条件下でIP₃R1にのみ結合する小胞体内腔タンパク質ERp44 を見いだしました。IP₃R1 は他のサブタイプに比べ、特に脳での発現が多いサブタイプとして知られています。（図３）
　当初、ERp44 がカルシウムシグナル伝達制御に関与するという知見は無く、また、IP₃R1がレドックス制御されているか否かは不明でした。しかし、研究グループはERp44 がIP₃R1のレドックス制御に関与し、そのカルシウム放出活性を制御していると考えました。その可能性を示唆する事実としてIP₃R1 のL3Vに存在するシステイン残基の存在があげられます。
　興味深いことに、L3Vのアミノ酸配列は３つのサブタイプ間で非常に相同性が低いにも関わらず、３つのシステイン残基が完全に保存されていました。 　そこで、それらシステイン残基を他のアミノ酸に置換したところ、ERp44 とIP₃R1 との結合が顕著に減少していることがわかりました。また、これらのタンパク質は酸性条件もしくは中性条件でも還元剤が存在すれば結合しました。これらのことは、ERp44 とIP₃R1 の結合がL3Vのシステイン残基のレドックス状態に依存していることを示しています。また、人工脂質膜を用いた単一チャネル電流測定法によって、ERp44 が小胞体内腔レドックス状態依存的にIP₃R1 の活性を制御することが明確に示されました。これらin vitroでの再構成実験に加え、in vivoにおいてもERp44 のIP₃R1 活性への影響を調べるため、細胞内カルシウムイメージング実験を行いました。（※５）
　様々な細胞を用いて調べた結果、IP₃R1 を多く、またはそれのみを発現しているHeLa,DT40-KMN60 細胞においてERp44 はIP₃R1 を介したカルシウム放出を抑制していることがわかりました。一方、IP₃R1 が少ない、または全く発現していないCOS-7, DT40-1KO細胞では、そうした抑制は観察されませんでした。 　また、RNA干渉法によってERp44 の発現を減少させると、IP₃R1 を介したカルシウム放出が顕著に増大しました。更に、ERp44 との結合が低下するシステイン変異を導入したIP₃R1とERp44 をDT40-TKO 細胞(IP₃Rsを全く発現していない細胞)に共発現させても、ERp44によるIP₃R1 活性の抑制は観察されませんでした。これらの実験によって、ERp44 がIP₃R1活性をIP₃R1 のシステイン残基依存的に抑制することが示されました（図４）。こうして、分子生物学、生化学、細胞生物学、電気生理学的手法を用いて、IP₃R1 が小胞体内腔側から、結合タンパク質によって、小胞体内腔の環境、特にレドックス状態依存的、そしてサブタイプ特異的に負の制御を受けるという、全く新しい機構が示されました。（図５）
　まとめると、チオレドキシンファミリーに属するタンパク質ERp44 が、カルシウムチャネルであるイノシトール１、４、５－三リン酸(IP₃)受容体(IP₃R)タイプ１(IP₃R1)に結合し、そのカルシウム放出活性を制御することを見いだしました。このことにより、レドックス制御とIP₃Rを介したカルシウム情報伝達が、深く関連していることが初めて示されました。とくに小胞体内腔のレドックス状態を認識する分子の発見は初めてで、しかもIP₃Rと直接連携してカルシウムを制御するため、この発見の意義は大変大きいものです。

３．今後の期待

　細胞内カルシウム恒常性の撹乱は細胞応答の異常、曳いては様々な疾患を引き起こすことが知られています。特に最近、IP₃R1 のカルシウム放出活性の異常がアルツハイマー病やハンチントン病の発症に関与していることが報告され、また、レドックス状態の制御不全が、加齢に伴う様々な老化現象を引き起こす一因と考えられています。ERp44 を過剰発現させると細胞死を抑制するという結果も含めて、今回の発見が、様々な疾患や神経細胞死の機構の解明に貢献することが期待されるとともに、新たな細胞内シグナル伝達経路の発見にとどまらず医学・健康科学における応用も期待されます。（図６）