小田 吉哉（エーザイ株式会社 シーズ研究所 主幹研究員）
定量的メタボロミクスとプロテオミクスの融合
平成17年度 平成18年度 平成19年度
§1．研究実施の概要
我々はメタボローム解析をプロテオーム解析と同じ程度まで容易にする試みから始めた。そのために高速液体クロマトグラフィー（HPLC）という安定した分析計と質量分析（MS）を使って極性代謝物分析系の構築を開始した。これまで正の電荷を持ちうる代謝物についてはコーティングしたキャピラリーカラムを使うことによって逆相系ナノLC/MS分析が可能となり、ATPなどリン酸含有代謝物は陰イオン交換カラムと順相様ナノLC/MS分析が可能となった。しかし同時にソフトウエア、前処理、感度において課題があることが明確になった。ソフトウエアについては異なるMS装置で分析したデータの解析を可能にしたMS++を開発し、自動高速バッチ処理を可能にしたJobRequestを開発してウエブにて一般公開を開始した。しかし未知代謝物の自動同定システム開発については未着手であった。前処理については古くて新しい問題でもある。つまり同じサンプルでも前処理が異なれば、結果が異なる。そのため相対定量であれば大きな問題にならないであろうが、絶対定量については依然困難である。感度については哺乳類細胞中では検出限界以下の代謝物も多々あり、サンプルの前処理法の改良と合わせた取り組みが必要である。
§2．研究実施内容
細胞内にある種々の生体物質を網羅的に解析することによって生命現象を理解しようとするためには、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、そしてこれらを統合するためのシステムバイオロジーが必要である。我々はトランスクリプトミクスについては必要な情報を得ることができるシステムを有しており、プロテオミクスについては既にトップレベルの技術基盤を構築していると自負している。これらに比べてメタボロミクス関連技術は我々の取り組みだけでなく、世界的に見ても他のオミクスに比べると技術開発が遅れている。そこで我々は極性メタボローム解析をプロテオーム解析と同じ程度まで容易にする試みから始めた。
まず極性代謝物についてアミノ酸など正電荷を帯びる代謝物とATPなどリン酸含有代謝物に分けて、分析計としてはもっとも汎用性が高いLC/MSによる分析法を構築した。また感度を上げるために石橋カラムによるナノLCカラムを使用した。正電荷代謝物の場合、逆相カラムによってもっとも良いピーク形状が得られたがカラム内径を細くするに従ってピーク形状が大幅に悪くなった。しかしキャピラリー内壁をコーティングしてから石橋カラムを作ることでこの問題は解決した。リン酸含有代謝物については順相様のナノLCカラムで良好なピーク形状を得ることができたが分離と試料負荷量が充分でなかった。そこで陰イオン交換カラムをオンラインで直列に使うことによってこの問題を解決できた。試料の前処理では、我々が既に開発していたピペットチップ型脱塩濃縮チップ、SPE C-tipの固相をC18, SCX, SAXなど種々変えると同時にHPLC分析で汎用されているイオンペア試薬を組み合わせることによってある程度解決できた。しかしリン酸含有代謝物分析では試料中のリン酸(H3PO4)が妨害物質となることが明らかとなったが、これは培養細胞の取り扱いにおいて、PBS（Phosphate Buffer Saline）の代わりに生理食塩水を使うことで解決できた。ただし細胞から代謝物を抽出する際に、培養細胞を採集して直ちにメタノール溶媒を添加する方法と、細胞を液体窒素で凍結し溶解する方法では、代謝物によって量が大幅に異なってしまった。これは細胞採集後の代謝酵素活性による影響と、メタノールによる除タンパク質と代謝物の共沈という人為的な要因によるものである。現時点では、コントロールとサンプルとを同時に処理して測定するという相対定量であれば問題は少ないであろうと思われるが絶対定量では、問題を残したままとなった。またこれまでの測定結果からヒト由来の細胞中における正電荷極性代謝物やリン酸含有代謝物はダイナミックレンジが広いため一度に検出できる数はあまり多くなかった。装置のダイナミックレンジはMSに依存しているため、検出限界以下の代謝物群については別途注入試料量を増やすか、誘導体化を行うなどの方策が必要であろう。（エーザイ：小田グループ）
現在いろいろなMS装置が市販されていて、製造メーカーが異なれば、あるいは同じメーカーでも機種が異なれば、解析ソフトウエアが異なり互換性がない。よってMS装置ごとに異なるソフトウエアが必要になる。また通常MS装置一台につきライセンスが一つであるため研究室内にある複数のコンピュータで使用するためには追加ライセンスを購入しなければいけない。さらにメタボロミクスは新しい学問であり、どのようなデータを集め解析するかは未だ試行錯誤の状況である。よって新たなアイデアや改良を思いつく度に抽出するべきデータも変わる。ここで指すデータとはMS装置から得られるm/zとその強度であり、MS/MSスペクトルならプレカーサーイオンの値、LC/MSなら溶出時間やマスクロマトグラムにおけるピーク面積などである。しかしMSメーカーが供給する既存のソフトウエアでは自分らに必要な情報を自由自在に、かつ自動で取り出し加工することができない。そこでこれらの課題を解決するために、MS装置から得られるデータを読み込める「MS++」を開発した。現在MS++ではサーモフィッシャー社のLCQ/LTQ/TSQにおけるXcalibur、アプライドバイオシステムズ社のQsatrにおけるAnalyst QS、ウオーターズ・マイクロマス社のQ-TOFにおけるMassLynxの測定データを読み込むことができ、さらにアプライドバイオシステムズ社の4000QTRAPにおけるAnalyst 1.4や島津製作所のLC/MSやGC/MSのデータにも対応中である。さらにプロテオミクスで提唱されている（しかし普及していない）m/zXML形式ファイルにも対応中である。MS++ではこれらのデータを読み込め、必要な情報を取り出せるだけでなく、独自の形式やm/zXML形式に保存することもできる。つまり一度MS++独自形式に保存さえすれば、ライセンスを気にせず自由にどのコンピュータでも解析できる。さらにMS++ではファイルごとの独自形式の保存に加えて、指定したスペクトルごとに独自形式で保存できる。これはメタボロームデータベース構築を意識して作成したものである。ところでMS++はプラグイン方式のソフトウエアとなっているため、研究者各自で必要な機能を追加したり、逆に不要な機能を削除したりできる。しかしMSデータを自由に解析できるように作っているため、MSデータ解析については手動で（一つずつ）対応しなくてはならず、自動処理には不向きなソフトウエアである。そこで我々は別途JobRequestと称したソフトウエアを構築した。これはMS++の持つ機能をバッチ式に自動処理させる役割を持つ。例えば指定したスペクトルやファイルを一括してMS++形式に保存したり、m/z値やピーク強度を一括してリスト化したりする作業である。また通常、一つの研究室内には複数のコンピュータがあるため、これらのCPUを有効利用して、一つのジョブを複数のコンピュータに割り当てることで演算処理を高速化している。残念ながらJobRequestではメタボロミクス用の自動同定システムを搭載していないが、プロテオミクス用としてX!Tandemを搭載している。これは現在普及している検索エンジンMascotよりも高速な同定エンジンである。メタボロミクス用としては、実際の測定データ（仮想データでも可能）に基づいたMS/MSスペクトル情報と、新たな測定によって得られたMS/MSスペクトルを照合するシステムX! Hunterを搭載する予定である。なおJobRequestはオープンソース・ソフトウエアのためユーザー自身で自由に書き換えができる。MS++およびJobRequestについてはCRESTのホームページにて公開しており、自由にダウンロードできる（http://www.cellmetabo.jst.go.jp/ja/topics/jobrequest.html）。（エーザイ：小田グループ）
キャピラリーLCやCEに応用可能な新規カチオン性ポリマーコートキャピラリーの開発を行った。本コート法は、ケイ酸のシリカゲルへの重合反応を利用したもので、様々なポリマーを重合反応時に共存させておくことで、フューズドシリカキャピラリー内壁に任意のポリマーを固定化するものである。カチオン性ポリマーであるポリブレンやDEAEデキストランを固定化したキャピラリーをメタボローム分析に応用したところ、従来法に比べ、再現性および頑健性に優れた方法を確立することができた。本成果は学会発表し、現在論文準備中である。またMSとのインターフェース部においてネブライザーガスフリーでも安定してイオン化できるインターフェースを構築し、キャピラリー分離における分離性能を向上させた。本法をメタボローム分析に応用し、今まで分離できていなかったリン酸化糖異性体の完全分離に成功した。本成果についても学会発表し、現在論文準備中である。データ解析関連ではプログラミング言語としてPerlを用いたデータ解析スクリプトを数十種類開発し、LAN経由でサーバー中のスクリプトを動作させ、データ解析の一元化、高速化するシステムを実現した。一部のスクリプトは外部にも公開した（例えば、http://empai.iab.keio.ac.jp/）。（慶應大学：石濱グループ）
§3．成果発表等
(1)論文（原著論文）発表
（エーザイ：小田グループ）
- ソフトウエア、MS++ & JobRequestの一般公開
URL: http://www.cellmetabo.jst.go.jp/ja/topics/jobrequest.html
（慶応大学：石濱グループ）
- 発表総数（国内1件）
- 論文詳細情報：Ishihama, Y., Optimization of nanoLC-MS systems for proteomics, Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan, in press.
