| チームリーダー ： |
池滝 慶記【オリンパス（株） 未来創造研究所 リサーチコーディネータ】 |
| 中核機関 ： |
オリンパス（株） |
| 参画機関 ： |
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- Ⅰ．開発の概要
- 生命科学の研究現場では、細胞内の生命現象を司るサイズ100 nm以下のオルガネラの機能を分析できるツールが強く求められている。本課題では、蛍光抑制効果を用いた超解像顕微法において、横および深さ方向の分解能を同時に向上できる照明光学系を開発する。本光学系を市販のレーザー走査型顕微鏡を搭載し、オルガネラを空間的に2点分解できるゼプトリットルの立体分解能をもつ３次元超解像顕微鏡システムを実現することを目標とする。
- Ⅱ．開発項目
- （１）２次試作によるハイブリッド位相板による３次元超解像機能の評価
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① 蛍光スケールによる2点分解能の評価
提案するハイブリッド位相板に関して、そのビーム変調機能の確認にとどまった。イレース光は理論形状に近いスーパーダークホールを有するものの、位相変調用の光学膜の製膜時のマスク合わせの精度が不足し、蛍光スケールを空間分解できる充分な超解像機能を提供できる位相板を作製できなかった。しかしながら、従来型の輪帯位相板を用いて、80 nm L&S(Line and Space)ラインパターンを空間分解できた。また、横方向の超解像機能に特化したスパイラル位相においては、明瞭に70nm L&Sラインパターンを分解できた。
② 蛍光ビーズによる３次元点像分布関数の評価
ハイブリッド位相板に関しては顕著な横方向の分解能の向上は確認できなかった。また、深さ分解能は、回折限界の半分の300 nmの分解能が得られるにとどまった。一方、輪帯位相板においては、80 nm立方の３次元分解能が得られた。スパイラル位相においては、50 nmの横分解能が得られた。
- （２）生物試料による超解像機能の確認
- ① 微小管染色サンプルによる分解能評価
蛍光スケール及び蛍光ビーズの計測評価において目標とする数値が達成できなかったので、ハイブリッド位相板に関しては、複雑な空間形状を有する微小管染色サンプルによる超解像機能評価は未実施となった。
また、従来型の輪帯位相板において、商用色素Alexaにより抗体染色した微小管サンプルを超解像計測したところ、蛍光ビーズによる評価と同等の横方向：80 nm、縦方向：90 nmの立体分解能が得られた。また、スパイラル位相においては、少なくとも70 nmより高い横分解能が得られ、顕著な解像度の向上が確認できた。
- Ⅲ．評 価
- 本課題は特殊な位相板と二つのレーザー(一方は蛍光励起用、他方は蛍光抑制用)を用いることにより、焦点近傍の極微小な領域のみで蛍光が発生するように工夫された顕微鏡用照明光学系の開発である。光軸方向、面内方向の双方において当初設定していた分解能(横分解能：50 nm 縦分解能：50 nm)にはわずかに届かなかったものの、輪帯位相板において80 nm立方の三次元分解能、スパイラル位相板において横分解能50 nmをそれぞれ達成しており、ハイブリッド位相板については改良の余地を残すものの、ほぼ目的を達成したものと判断する。本照明光学系の最大の特長は、位相板を対物レンズに装着するのみで商用のレーザー走査型顕微鏡に超解像機能を手軽に技術搭載できることである。本開発成果は多くのユーザーに超解像顕微鏡技術の利用を可能にし、ライフサイエンスの発展に大きく貢献できることが期待できる。競合技術であるSTED法の特許が失効したことなど追い風となる状況を考えると、早期の商品化が期待される。本開発は当初の開発目標を達成し、本事業の趣旨に相応しい成果が得られたと評価する[Ａ]。
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