Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）は、骨格筋膜直下からジストロフィンが欠損することで発症する重篤な遺伝性筋疾患である。現在、有効な治療法はなく、ジストロフィン発現と筋再生能の回復を企図する幹細胞移植治療の開発が期待される。幹細胞移植法としては、免疫応答等の点からautologous transplantationが最も注目されるが、（1）どこに幹細胞を求めるのか （2）どのようにexpand(増殖)させるのか （3）どのように筋細胞への分化をさせるのか、という点について意見の一致をみていない。そこで、本研究では 1）ヒト骨格筋から幹細胞を効率よく分離し、2）増殖能と分化能を維持したまま、移植に十分な細胞数まで増殖させる技術を確立する。

研究代表者

分担代表研究者

本研究ではマウスでの研究成果に基づいて、ヒト骨格筋から、特異抗体とセルソータを用いて幹細胞を分離し増殖能と分化能を維持したまま、移植に十分な細胞数まで、培養により増やすプロトコルの確立を目指す。さらにDMD患者骨格筋から、筋・幹細胞を調整しex vivoでレンチウイルスベクターを用いて、ミニ・ジストロフィン遺伝子（6.4 kbで、全長型のジストロフィンとほぼ同等の機能を有する）を導入した後、筋ジストロフィー・モデルマウスに移植し、治療効果と安全性を検討する。
さらに、最近、ヒト線維芽細胞からのES細胞様の多能性幹細胞（iPS細胞）の誘導が報告されており、筋疾患への治療応用が期待されている。そこで筋ジストロフィーモデルマウスからのiPS細胞の樹立を行い、筋分化誘導をかけて、その治療法への応用の可能性をマウスへの移植実験を行い、検討する。

(1)	DMD患者骨格筋からの単核細胞の調整 DMD患者及びコントロールの生検筋から、トリプシン，コラギナーゼ等を用いて単核細胞を分離する。
(2)	骨格筋からの幹細胞分離、培養技術の開発 1）筋・幹細胞の純化法と培養法の検討 （1）で調整した単核細胞からセルソータと抗体を用いて、筋分化能を持った幹細胞を分離（純化）する。その際に、マウスにおける幹細胞の分離に有効であったSM/C-2.6抗体と共にSM/C-2.6抗体の抗原と思われる分子に注目する。更に、分化能、増殖能を良好に保つ培養条件について、無血清培地に着目しながら検討し、プロトコルの作製に着手する。
	2）多能性幹細胞の調整 マウス骨格筋組織からセルソータを用いた多能性幹細胞（メソアンギオブラスト）の調整方法を検討する。具体的にはマウス骨格筋から単核細胞を分離後、各種細胞表面マーカーで分画した後、多能性幹細胞を含む分画を同定する。
	3）筋ジストロフィーモデルマウス骨格筋組織からのiPS細胞の樹立と分化能の解析 各週齢のmdxマウスおよびコントロールマウスの線維芽細胞ないしは筋芽細胞からiPS細胞を樹立する。その際に、iPS細胞ないしはES細胞から筋細胞を誘導する方法についてはIGF-2を用いる方法が提案されてはいるが、充分確立されていないことに改めて着目し、誘導方法の確立を計る。
(3)	マウスへの移植実験 調整した幹細胞をジストロフィン欠損免疫不全マウスであるmdx/scidマウスに移植することにより、分化能、増殖能を検討する。

独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター神経研究所 遺伝子疾患治療研究部
ホームページ　http://www.ncnp.go.jp/nin/guide/r_dna2/index.html●