ヒトiPS（induced pluripotent stem cells）細胞の開発により線維芽細胞を始めとする自己細胞を用いた再生医療の実現が極めて現実的になってきてはいるものの、そのゴールとなる同細胞より安全かつ高効率に各種分化幹・前駆細胞を得る技術はまだ確立されていない。さらにヒトiPS細胞の作製においてはこれまでの報告において全て染色体DNAにランダムな遺伝子挿入がなされるレトロもしくはレンチウイルスベクターが用いられており、遺伝子挿入箇所に依存した重要遺伝子発現抑制による細胞機能不全や、癌関連遺伝子活性化に由来する発癌性誘導等の危険性に関しては全く明らかになっていない。すなわちiPS細胞を元に各種分化幹・前駆細胞を作製する場合に、これらの極めて重要な問題点を先ず解決することが急務であると考えられる。一方、造血幹・前駆細胞（以下造血幹細胞と略）においては血液疾患に対する造血細胞移植療法の細胞ソースとしてのみならず、多種細胞への分化能やその再生を補助する機能を有するという基礎的研究成果が報告されており、広範な再生医療に用いる細胞源としての有用性が期待されているものの、現在そのin vitroにおける高効率増幅法や具体的な他種細胞への分化法は開発されておらず、この点についても今後集約的研究の実施が急務であると考えられる。以上の現状を鑑み、本研究の目的は申請者らがこれまでに報告してきた遺伝子導入による非ヒト霊長類ES細胞よりの造血細胞高分化系を基本に、特にヒトiPS細胞ならびにヒトES細胞への遺伝子導入による安全かつ高効率な造血幹細胞分化法を確立することである。

研究代表者

分担代表研究者

　ヒトiPS細胞の開発により自己細胞を用いた再生医療の実現が極めて現実的になってきたものの、同細胞より安全かつ高効率に分化幹(前駆)細胞を得る技術はまだ確立されていない。本研究では多種細胞への分化能を持つことが知られている造血幹細胞に焦点を当て、ヒトiPS細胞ならびにヒトES細胞への遺伝子導入により造血幹細胞への分化系を確立する。具体的には申請者らがこれまでに報告してきた遺伝子導入による非ヒト霊長類ES細胞よりの造血細胞高分化系を基本に、既に作成済みのヒト胎児肝臓cDNA発現レンチウイルスベクターライブラリーならびにマウスAGM領域由来造血幹細胞cDNAマイクロアレイ法等を駆使して新規造血幹細胞分化遺伝子を同定し遺伝子導入することで、ヒトiPS細胞およびES細胞よりの高効率造血幹細胞分化系を確立し、両者間の比較検討を詳細に行う。併せて本方法の安全性を担保する目的で染色体非挿入遺伝子導入ベクターを用いた検討を行う。

計　画

(1)	これまでに我々が確立したTal1/Scl遺伝子導入による非ヒト霊長類ES細胞よりの造血細胞高分化系(Kurita,R.,Tani,K.,et al.,Stem Cells 2006)を基本に、既に作成済みのヒト胎児肝臓cDNA発現レンチウイルスベクターライブラリー(Kurita,R.,Tani,K.,et al.,submitted)を用いて、ヒトiPS細胞ならびにヒトES細胞から高い効率で造血幹細胞に分化誘導可能な遺伝子をin vitroコロニー形成能を用いたスクリーニング法及び免疫不全マウスへの移植実験により同定する。
(2)	正常ならびに成体骨髄再構築不全(Runx1,Evi-1,c-Myb,Twist-1等)ノックアウトマウスの各9.5dpcならびに10.5dpcのAGM領域由来造血幹細胞より作製したcDNAマイクロアレイ解析情報を元に新規造血幹細胞分化遺伝子を同定し、各候補cDNAについてヒトcDNAをクローン化・各発現レンチウイルスベクターを作製後、ヒトiPS細胞ならびにヒトES細胞への遺伝子導入を行い、in vitroならびに免疫不全マウスin vivoでのヒト由来造血細胞誘導能の高い分子を選定する。
(3)	レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（特に血清型35型(Ad35)）、麻疹ウイルスベクターを用いて小型霊長類コモンマーモセット（CM）ES細胞mRNAよりクローン化したOct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28 のcDNA発現ウイルスベクターを作製し、既に樹立済みのCM線維芽細胞に各種条件で遺伝子導入を行い、CMiPS細胞の樹立を目指す。

目　標

(1)	ヒトiPS細胞ならびにヒトES細胞から高い効率で造血幹細胞に分化誘導可能な候補遺伝子を２つの方法で探索する。
(2)	CM線維芽細胞に３種のベクターを用いて遺伝子導入を行い、CMiPS細胞の樹立を目指す。