肺がんの薬剤耐性原因を解明

＜研究の背景と経緯＞

たんぱく質のチロシン残基をリン酸化する酵素であるチロシンキナーゼは私たちの細胞の増殖を制御する重要な分子ですが、点突然変異や遺伝子融合などさまざまなゲノム変異によって恒常的活性型となることで発がんを誘導します。

肺がんは先進国におけるがん死因の第１位を占める予後不良の疾患です。本研究グループは２００７年に肺がんの一部で２番染色体内の微小な転座が生じた結果、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合がん遺伝子が生じることを発見しました（図１、参考論文１）。ＡＬＫは受容体型チロシンキナーゼですが、その酵素領域がＥＭＬ４と融合することで酵素活性が上昇し強力ながん化能を獲得したＥＭＬ４－ＡＬＫキナーゼになるのです。さらに本研究グループは２００８年に、ＥＭＬ４－ＡＬＫキナーゼを肺特異的に産生する遺伝子改変マウスを作成し、このマウスが生後すぐに両肺に数百個もの肺腺がんを多発すること、またそのようなマウスにＡＬＫ阻害剤を投与すると肺がんが消失することも報告しました（参考論文２）。これらの発見を受け、実際の肺がん患者に投与するＡＬＫ阻害剤の開発が多くの製薬会社で行われており、すでに１社は独自のＡＬＫ阻害剤（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ^注４））による第一相・第二相臨床試験を終了し、その成果を２０１０年の米国臨床腫瘍学会総会で発表しました（参考論文３）。それによるとｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂの投与により、約９割の症例で腫瘍サイズがコントロールされ、完全寛解症例（腫瘍が消失する）まで出現するという驚くべきものでした。しかし一部の症例はｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂが効きませんでした。このようなＡＬＫ阻害剤耐性の原因は全く不明でした。

本研究グループは今回、ＡＬＫ阻害剤が著効したものの半年後に突然再発した症例のがん細胞を解析することで、薬剤耐性メカニズムを明らかにすることに成功しました。

＜研究の内容＞

２０１０年春まで日本においてはＡＬＫ阻害剤による臨床試験が行われてこなかったため、これに先立ち本研究グループは２００９年春より、日本のＡＬＫ肺がん患者を救うべくボランティアのＥＭＬ４－ＡＬＫ診断ネットワーク事業を行ってきました。本活動によりＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性と診断された患者の一部は、海外で行われるＡＬＫ阻害剤の臨床試験に参加して治療を受けてきました。そのなかに、ＡＬＫ阻害剤治療によって当初腫瘍の著しい縮小や呼吸困難などの臨床症状の消失をみましたが、約５ヵ月間の治療後に突然再発し、薬剤耐性肺がんへと移行した患者がいました。

そこで、本症例で生じた薬剤耐性メカニズムを明らかにするべく、ＡＬＫ阻害剤による治療前と再発後の患者がん細胞の比較を試みました。具体的な解析試料は前者が喀痰（かくたん）、後者が胸水であり、それぞれの試料内にがん細胞がどの程度の割合存在するかは全く不明です。そこで微量のがん細胞しか含まれていない試料からでも遺伝子変異を高感度に検出できるように、次世代ＤＮＡシークエンサーを用いた解析を行いました。ＥＭＬ４－ＡＬＫの酵素活性領域に新たな付加変異が生じている可能性を検証するため、ＡＬＫ酵素活性領域のｃＤＮＡを次世代ＤＮＡシークエンサーによって解析し、治療前と再発後での変化を調べました。その結果、再発後にのみ新たに２種類の塩基置換（４３７４番目の塩基のＧ→Ａ置換と４４９３番目の塩基のＣ→Ａ置換）がＡＬＫ酵素活性領域に出現していることを発見しました（図２Ａ）。前者の塩基置換はＥＭＬ４－ＡＬＫキナーゼの１１５６番目のアミノ酸であるシステイン（Ｃ）をチロシン（Ｙ）に置換し、後者の塩基置換は１１９６番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）をメチオニン（Ｍ）に置換します（図２Ｂ）。

さらに興味深いことに、これら２種類の変異は別々のｃＤＮＡ上に生じており、この結果からＣ１１５６Ｙ変異を有するがん細胞クローンとＬ１１９６Ｍ変異を有するクローンは患者腫瘍組織内において互いに独立に出現していることが明らかになりました。

次に、この２種類のアミノ酸変異が薬剤耐性の原因であるのかをマウス細胞で調べました。すると、ＥＭＬ４－ＡＬＫキナーゼを発現するマウスＢ細胞株ＢＡ／Ｆ３は、ＡＬＫ阻害剤（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）を投与すると速やかに細胞死が誘導されましたが、ＥＭＬ４－ＡＬＫ（Ｃ１１５６Ｙ）やＥＭＬ４－ＡＬＫ（Ｌ１１９６Ｍ）キナーゼを発現するＢＡ／Ｆ３細胞は、はるかに高濃度のｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂを投与しなければ死滅しません（図３上）。すなわち、Ｃ１１５６ＹおよびＬ１１９６Ｍ変異のどちらも薬剤耐性を付与することが確認されました。しかも、本変異はｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ治療中に生じたものであるにもかかわらず、別のＡＬＫ阻害剤である２，４‐ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（ＰＤＤ）に対しても、同様に耐性を獲得することが示されました（図３下）。従って本研究グループが発見した薬剤耐性変異は、広くＡＬＫ阻害剤一般に対して耐性原因となる遺伝子変異であると予想されます。

このＣ１１５６ＹやＬ１１９６Ｍ変異がどのようなメカニズムで薬剤耐性をもたらすかを検討するため、ＡＬＫ酵素活性領域の立体構造モデル上にＣ１１５６とＬ１１９６部位を示したのが図４です。チロシンキナーゼは上下の２種類の丸い構造体が中央の“ちょうつがい”でつながっているような構造をしており、その“ちょうつがい”部分に酵素活性の補酵素であるＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）^注５）が結合します。またｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、ＰＤＤを含む多くのキナーゼ阻害剤は、このＡＴＰ結合ポケットにＡＴＰと競合的に結合し、酵素のＡＴＰとの結合と活性化をブロックします。Ｃ１１５６はＡＴＰ結合ポケットの上端に位置しており直接ＡＴＰとは接していないと予想されますので（図４左）、この部位がチロシンに変化することで酵素上部の変形が生じ阻害剤の挿入が不可能になったのではないかと予想されます。一方Ｌ１１９６部位はＡＴＰ結合ポケットの最深部に位置しますので（図４右）、この部位が、大きな側鎖を持つアミノ酸であるメチオニンに置換されることでＡＬＫ阻害剤が結合できなくなったと考えられます。

興味深いことにこのＬ１１９６部位は、他のがん化チロシンキナーゼが薬剤耐性となる際に変異する場所と同じでした。肺がんの一部はＥＧＦＲ^注６）チロシンキナーゼの活性型異常によって生じると考えられますが、そのような症例にはＥＧＦＲ阻害剤（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ／ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）が有効であることが知られています。しかし、ＥＧＦＲ阻害剤の治療中に一部の症例が薬剤耐性となることがあり、その細胞の解析から７９０番目のスレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）へ変化することが薬剤耐性の原因であることが明らかになっています（図５）。また、慢性骨髄性白血病はＡＢＬチロシンキナーゼが染色体転座の結果ＢＣＲと融合してＢＣＲ－ＡＢＬ^注７）融合チロシンキナーゼが生じることにより発症しますが、そのような症例にはＡＢＬの酵素活性阻害剤であるｉｍａｔｉｎｉｂが有効です。しかしｉｍａｔｉｎｉｂ治療中に薬剤耐性となる症例が出現することがあり、ＡＢＬ内の３１５番目のアミノ酸であるスレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）へと変化する異常が最も重要な薬剤耐性原因であることが分かっています（図５）。ＥＧＦＲのＴ７９０もＡＢＬのＴ３１５もどちらもＡＴＰ結合ポケットの最深部に位置しており、この場所は「ｇａｔｅ ｋｅｅｐｅｒ（守衛）部位」と呼ばれています。今回の発見で、ＥＧＦＲやＡＢＬとは全く異なるキナーゼ（ＡＬＫ）を全く異なる阻害剤で治療したにもかかわらず、同じｇａｔｅ ｋｅｅｐｅｒ部位の変異が薬剤耐性をもたらすことが分かりました。

＜今後の展開＞

今回の発見により、ＡＬＫ阻害剤の耐性メカニズムが解明され、チロシンキナーゼ阻害剤耐性メカニズムに共通性があることが明らかになりした。これは今後のチロシンキナーゼ阻害剤の開発に大きな影響を与えると考えられます。まずＡＬＫ肺がんに対する治療だけに限っても、これ以降の新たなＡＬＫ阻害剤開発の際にはＣ１１５６Ｙ変異やＬ１１９６Ｍ変異があっても有効にＡＬＫ阻害活性を発揮しうる（つまりＡＬＫのＡＴＰ結合部位に結合しうる）構造を有するＡＬＫ阻害剤を開発すればよいことになります。

しかも今回の発見は、チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性メカニズムとしてｇａｔｅ ｋｅｅｐｅｒ部位の異常が、チロシンキナーゼ・阻害剤の種類にかかわらず広く共通の原因となることを示唆しています。従って、どのような酵素を対象とした場合でも、そのＡＴＰ結合部位に競合的に結合する阻害剤を開発する場合は、ｇａｔｅ ｋｅｅｐｅｒ部位に大きな側鎖を持つアミノ酸が挿入されたとしても阻害活性を失わないような化合物を最初からデザインするべきであるという指針が示され、今後の薬剤耐性がん治療への道が開かれました。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） チロシンキナーゼ

キナーゼとは基質をリン酸化する酵素の総称であり、そのうちチロシンキナーゼは基質たんぱくのチロシン残基をリン酸化する酵素のこと。一般にその活性化は私たちの細胞の増殖を正に誘導します。

注２） ＥＭＬ４－ＡＬＫ

肺がん細胞内において２番染色体内の小さな逆位が生じ、ＥＭＬ４遺伝子とＡＬＫ遺伝子が融合してＥＭＬ４－ＡＬＫがん遺伝子が生じます。ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子は、本来細胞内骨格に結合するＥＭＬ４たんぱく質のアミノ末端側約半分と、ＡＬＫ受容体型チロシンキナーゼの細胞内領域とが融合した異常たんぱく質を産生します。ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子は非小細胞肺がんの４～５％（５０才以下の肺がんの３５％）に生じることが知られています。

注３） 次世代ＤＮＡシークエンサー

核酸の塩基配列を決定する装置をＤＮＡシークエンサーと言いますが、一般に使用されているＤＮＡシークエンサーは一度の実験で多くとも数百種類のＤＮＡ断片しか解析できません。しかし次世代ＤＮＡシークエンサーと呼ばれる装置は、一度の実験で数百万から数億種類ものＤＮＡ断片を同時に解析可能であり、大量の塩基配列情報を比較的簡便に得ることができます。現在、３種類ほどの次世代ＤＮＡシークエンサーが入手可能です。

注４） ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ

ＡＬＫチロシンキナーゼとＭＥＴチロシンキナーゼの酵素活性を選択的に阻害する薬剤で、現在ＡＬＫ肺がんに対する国際第三相臨床試験が行われています。

注５） ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）

アデノシン三リン酸｡細胞内のさまざまな化学反応において広く利用される補酵素で、ＡＤＰ＋Ｐｉに分解される際に放出する高エネルギーが多くの化学反応に利用されます｡チロシンキナーゼはＡＴＰの分解エネルギーを利用するだけでなく、そこで生じるリン酸を直接基質のリン酸化反応に利用しています｡

注６） ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）

皮膚など上皮系の細胞に働いて、細胞増殖を促すたんぱく質を上皮成長因子と言いますが、その細胞側の受容体がＥＧＦＲです。ＥＧＦＲたんぱく質は細胞内領域にチロシンキナーゼ酵素活性を有しており、上皮成長因子が結合すると、そのキナーゼ活性が誘導されます。一部の肺がん症例において、ＥＧＦＲの遺伝子異常が見つかりました。この異常はＥＧＦＲたんぱく質のキナーゼ活性を高め、上皮成長因子が結合していない状態でも、ＥＧＦＲ酵素活性を上昇させて肺がん発症を誘導するとされています。

注７） ＢＣＲ－ＡＢＬ

慢性骨髄性白血病細胞において、９番染色体と２２番染色体との間で転座が生じ、前者に存在するＡＢＬ遺伝子と後者に存在するＢＣＲ遺伝子が融合したＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子が産生されます。ＡＢＬたんぱくはチロシンキナーゼとしての活性を有していますが、ＢＣＲと融合することで酵素活性が上昇し発がん能力を獲得します。なお正常ＢＣＲの機能は現在でもよく分かっていません。

＜参考論文＞

1. １） “Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer” Nature 448:561-566, 2007
2. ２） “A mouse model for EML4-ALK-positive lung cancer” PNAS 105:19893-19897, 2008
3. ３） “Clinical activity of the oral ALK inhibitor PF-02341066 in ALK-positive patients with non-small cell lung cancer (NSCLC)” J Clin Oncol 28:18s (supple; abstr 3), 2010

＜論文名＞

“Mutations of EML4-ALK in Lung Cancer That Confer Resistance to ALK Inhibitors”
（肺がんにおいてＡＬＫ阻害剤の耐性原因となるＥＭＬ４－ＡＬＫキナーゼ内付加変異の発見）

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自治医科大学 分子病態治療研究センター　ゲノム機能研究部　教授
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