理化学研究所（理研） 開拓研究本部 田中生体機能合成化学研究室の田中 克典 主任研究員、アンバラ・プラディプタ 基礎科学特別研究員、盛本 浩二 客員研究員、大阪大学 大学院医学系研究科の多根井 智紀 助教、野口 眞三郎 教授、カザン大学のアルミラ・クルバンガリエバ 准教授らの国際共同研究グループは、乳がんの手術中に摘出した組織で有機合成反応を行うことにより、乳がん細胞の有無だけでなく、がんのさまざまな種類（形態）を従来よりもはるかに短い時間で、簡易に識別できる診断技術を新しく開発しました（図）。
本研究成果は、従来の手術中における病理学的診断法に代わって、今後、乳がん切除範囲を迅速・簡易・安価に判断する世界基準の診断技術として活用されると期待できます。
田中主任研究員らは以前、酸化ストレス注１）条件下で、細胞で発生する「アクロレイン注２）」が蛍光基を持つ「アジドプローブ注３）」と有機合成反応し、細胞を蛍光標識できることを見いだしていました。今回、国際共同研究グループは、この有機合成反応を用いて、さまざまなヒトがん細胞でアクロレインが多量に発生していることを突き止めました。さらに、乳がん手術で摘出した“生”の組織にこの手法を適用したところ、わずか数分で９７％の高感度でがん細胞の有無を判別し、かつさまざまな種類の乳がんを識別することに成功しました。
本研究は、ドイツの科学雑誌『Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ』のオンライン版（２０１８年１１月２７日付け）に掲載されました。
本研究は、科学技術振興機構（ＪＳＴ） 戦略的創造研究推進事業 個人型研究（さきがけ）の研究領域「分子技術と新機能創出」（研究総括：加藤 隆史） 研究課題名「生体内合成化学治療：動物内での生理活性分子合成」（研究者：田中 克典）の一環として行われました。
＜背景＞
乳がんは、日本人女性で最も患者数の多いがんであり、１２人に１人の割合で罹患することが知られています※１）。現在、乳がん切除手術では、乳房の膨らみを残して乳腺を部分のみ切除する「乳房温存手術」が多く実施されています。この「乳房温存手術」では、手術中に端の乳腺組織（断端）での顕微鏡による診断（術中迅速組織診断）を行い、がんが残っていないかどうかを確認し、断端にがんが残っていた場合には、さらに乳腺組織を追加して切除することで、できるだけ乳がんを取り残さないように多くの病院で努力しています（図１）。また、退院後に最終的な顕微鏡検査（病理組織診断）で切除断端にがんが残っていた場合には、再度切除手術を行うことになり、乳がん手術の断端検査を厳密に行うことは患者にとっても大変重要です。
現在、手術中における断端検査には、ヘマトキシン・エオジン染色法（ＨＥ染色法）と呼ばれる病理学的診断が利用されています。ＨＥ染色法では、摘出した断端を凍結して切片にし、ＨＥ試薬を用いて染色した後、顕微鏡でがん細胞を検出しますが、１回の検査に４０分程度を要します。この間、全身麻酔の状況の患者と執刀医は結果を待つ必要があります。一方で、検査をする病理医の数が非常に少ないことも問題でした（図１）。そこで、乳がん患者の手術中の負担を減らし、都市の大病院から地方の病院に至るまで、多くの患者の手術を短時間で簡便に実施できる新しい迅速術中診断技術を開発することが求められていました。
２０１６年に田中主任研究員らは、酸化ストレス条件下で細胞内に発生する毒性の「アクロレイン」とテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）蛍光基を持つ「アジドプローブ」が選択的に反応し、１，２，３－トリアジン化合物が速やかに生成されることを見いだしました※２）。この１，２，３－トリアジン化合物がさらに細胞内で複数の有機合成反応を経ることにより、細胞中に蛍光基がとどまります。この蛍光基を利用してアクロレインを生成している細胞を１細胞レベルで蛍光標識できます（図２）。
一方で、がん細胞は酸化ストレス細胞であることが知られています。そこで、国際共同研究グループは、アクロレインとアジドプローブを用いることで、がん細胞だけを蛍光標識できる可能性があると考えました。
＜研究手法と成果＞
国際共同研究グループはまず、がん細胞でアクロレインが多量に発生しているか否かを調べました。３種類の正常細胞および乳がん細胞を含む８種類のがん細胞のそれぞれの培養液に対してアジドプローブを作用させた後、顕微鏡で蛍光観察を行ったところ、正常細胞に比べて、がん細胞で蛍光強度が著しく増大しており、それぞれの細胞が示す蛍光強度は、細胞が生産するアクロレインの量と比例することから、アクロレインががん細胞で選択的に多量発生していることが分かりました（図３）。
この方法で蛍光標識されたがん細胞をより詳しく調べたところ、がん細胞の中で選択的に複数の有機合成反応が進行したことが分かりました。これにより、さまざまながん細胞でアクロレインが多量に発生していることが初めて実験で示されました。
次に、手術中に摘出した“生”の乳がん組織にアジドプローブとアクロレインを反応させることにより、がん細胞を選択的に蛍光標識できるかを、乳がん組織とその周辺の正常組織を用いて調べました（合わせて６０例）。その結果、手術中に患者から摘出した乳がんの断端をアジドプローブ溶液に５分間浸すだけで、９７％の高い確率でがん細胞を判別できることが分かりました（図４）。
個々のがん細胞はさまざまな方式で集まり、さまざまな種類（形態）のがんを形成します。図２で示すように、アジドプローブを用いるとがん細胞を１細胞レベルで蛍光標識できるので、さまざまな“がんの形”の可視化が期待できます。そこで、７種類の乳がん（浸潤がん、非浸潤がん、増殖病変、小葉がん、乳頭腫［良性の腫瘍］、微小浸潤がん、微小非浸潤がん）を、それぞれアジドプローブ溶液に５分間浸した後、顕微鏡で観察したところ、さまざまな“がんの種類（形態）”を確認できることが分かりました。この結果はＨＥ染色法で得られた画像とほぼ同じ結果であり、アジドプローブ染色法を用いると従来のＨＥ染色法で得られた画像と同じ画像を５分で得ることが可能になりました（図５）。
＜今後の期待＞
今回、アクロレインという毒性化学物質に着目し、“アクロレインが多量に発生するがん細胞内で選択的に有機合成反応を行う”という画期的な視点で研究を進めることで、これまで長年使用されてきた手術中の病理学的診断法に代わる新しい診断技術の開発に成功しました。今後、乳がん診断検査の臨床研究を経て、多くの乳がん手術現場で本技術が活用されると期待できます。さらに、本技術と人工知能（ＡＩ）の画像診断技術との併用によって、乳がんの切除手術の効率化がいっそう進むことも期待できます。また、今後の臨床研究で、本技術が世界基準となり、専門的な技術や病理医の主観を必要としない技術が開発されれば、乳がんだけではなく、他のあらゆるがん手術の現場を改革すると考えられます。
＜参考図＞
図 手術中に切除する乳がん部位を迅速に見極める新しい診断技術
図１ 乳がんの術中診断に用いられている病理学的診断（ＨＥ染色法）
乳がんの手術でがん細胞が残っているか否かを調べるため、摘出したがん断端を凍結切片にして、ＨＥ染色を行う。ＨＥ染色は、さまざまな乳がんの種類（浸潤がん、非浸潤がん、小葉がん、乳頭がん、増殖病変など）を的確に判別できる反面、時間がかかり、画像の識別には、病理医の経験が必要とされる。
図２ アジドプローブを用いたアクロレインを発生する細胞の蛍光標識
酸化ストレスの条件下で発生する毒性のアクロレインは、細胞内でアジドプローブと選択的に［２，３］－双極子環化反応を起こして、１，２，３－トリアジン化合物が速やかに生成する。細胞内における低ｐＨ環境下で、１，２，３－トリアジン化合物はジアゾ化合物へと変換される。ジアゾ化合物が細胞内のさまざまなタンパク質と反応した結果、蛍光基が細胞中にとどまり、１細胞レベルで蛍光標識される。なお、図の赤丸の「蛍」はＴＡＭＲＡ蛍光基を示す。
図３ 正常細胞とがん細胞から発生するアクロレインの検出
- （Ａ）３種類の正常細胞と８種類のがん細胞の培養液にアジドプローブを作用させた後、蛍光顕微鏡により観察した画像。正常細胞は、左からヒト肺線維芽細胞（ＴＩＧ３）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト乳腺上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）を用いた。がん細胞は、左上からヒト乳がん細胞（ＳＫＢＲ３）、ヒト乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、ヒト膵がん細胞（ＢｘＰＣ３）、ヒト結腸細胞（ＨＴ２９）、ヒト乳がん細胞（ＭＣＦ７）、ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）、ヒト子宮頚部がん細胞（ＨｅＬａ Ｓ３）、ヒト前立腺がん細胞（ＰＣ３）を用いた。スケールは１０μｍ（１μｍは１，０００分の１ｍｍ）。
- （Ｂ）細胞に異なる濃度のアジドプローブを作用させて蛍光を測定した結果。アクロレインががん細胞選択的に多量発生していることが分かる。
図４ アジドプローブを用いた乳がん患者から摘出したがん細胞の判別結果
乳がん患者の手術で摘出したがん（２０例の浸潤がんと１０例の非浸潤がん）と正常乳腺（３０例）の断端をそれぞれアジドプローブ溶液に５分間浸した後、顕微鏡で観察し蛍光強度を測定した。２０μＭ（１μＭは１００万分の１Ｍ）のアジドプローブ溶液を使用することで、がんの有無を感度・選択性ともに９７％の高い確率で判別できた。
図５ アジドプローブ染色とＨＥ染色による乳がんの種類の比較結果
左側のアジドプローブによる染色画像では、赤がアジドプローブで染まったがん、青がＨｏｅｃｈｓｔ試薬により染まった細胞核を示している。アジドプローブによる染色法とＨＥ染色法の画像がほぼ同じ形態を示している。
＜用語解説＞
- 注１）酸化ストレス
- 生体内で酸化還元状態の均衡が崩れたとき、過酸化水素やヒドロキシラジカルを代表とする活性酸素が生産される。これらが生体内のタンパク質や脂質、あるいは核酸と反応し、生体にダメージを与える。この状態を酸化ストレスと呼び、がんや動脈硬化、アルツハイマー病や慢性疾患などの原因とされている。
- 注２）アクロレイン
- アルデヒド基が二重結合（または三重結合）と炭素－炭素結合を介してつながった構造を持つ化合物を不飽和アルデヒドといい、アルデヒド基につながる二重結合が、全て水素で置換されている分子がアクロレインである。不飽和アルデヒドは、アルデヒド基や二重結合の多数の部位で反応でき、反応性が高い分子で、特にアクロレインは不飽和アルデヒドの中で最も小さく反応性が高いため、生体内のさまざまな分子と反応する。また、毒性が非常に強い。
- 注３）アジドプローブ
- 窒素原子が直線上に３つ並んだ化学構造がアジド基である。この発表では、アジド基がＴＡＭＲＡ蛍光基に結合した分子をアジドプローブと呼ぶ。
＜論文情報＞
| タイトル |
“Cascade Reaction in Human Live Tissue Allows Clinically Applicable Diagnosis of Breast Cancer Morphology” |
| ＤＯＩ |
10.1002/advs.201801479 |
＜参考文献＞
- ※１）Hori M, Matsuda T, Shibata A, Katanoda K, Sobue T, Nishimoto H, et al. Cancer incidence and incidence rates in Japan in 2009: a study of 32 population-based cancer registries for the Monitoring of Cancer Incidence in Japan (MCIJ) project. Japanese journal of clinical oncology. 2015;45(9):884-91. DOI: 10.1093/jjco/hyv088
- ※２）２０１６年４月１２日プレスリリース「アクロレインの可視化に成功」 http://www.riken.jp/pr/press/2016/20160412_2/
＜お問い合わせ先＞
＜研究に関すること＞
田中 克典（タナカ カツノリ）
理化学研究所 開拓研究本部 田中生体機能合成化学研究室 主任研究員
Tel：048-467-9405 Fax：048-467-9379
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＜ＪＳＴ事業に関すること＞
中村 幹（ナカムラ ツヨシ）
科学技術振興機構 戦略研究推進部 グリーンイノベーショングループ
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