遺伝子のスイッチを「光」と「薬剤」で制御できる新技術を開発

＜背景＞

脳を構成するニューロン（神経細胞）^注２）やグリア細胞^注３）であるアストロサイト、オリゴデンドロサイトは、神経幹細胞から生み出されます。京都大学 大学院生命科学研究科　今吉 格　特定准教授らの研究グループでは、神経幹細胞に発現する転写因子^注４）に着目し、神経幹細胞の細胞増殖や細胞分化の過程で、これらの転写因子がダイナミックな遺伝子発現パターンの変化を示すことを見いだしてきました。しかし、この複雑な遺伝子発現変動の機能的な意義の多くは未だ明らかになっていません。そこで、このような複雑な遺伝子発現パターンを人工的に制御し、その機能的意義を検証できる技術の開発が必要であると考えてきました。

これまでの研究では、光照射によって遺伝子発現のオン／オフを制御するシステムとして、光感受性の人工転写因子ＧＡＶＰＯを用いたＧａｌ４／ＵＡＳシステム^注５）が知られていました。しかしながら、このシステムでは光照射しない暗所においても遺伝子発現の誘導活性が見られたり、光照射を止めても遺伝子発現のオンの状態が残っている、といった欠点がありました。一方、最近さまざまな光感受性の遺伝子発現制御システムが開発されつつありますが、主に酵母細胞を用いて最適化が進められており、ヒトやマウスなどの哺乳類細胞では機能しない場合が多く存在しました。

また、「光」による遺伝子発現の制御法とは別に、「薬剤」であるテトラサイクリンやドキシサイクリン（Ｄｏｘ）という低分子化合物によって遺伝子発現を制御するテトラサイクリン誘導系（Ｔｅｔ）システムが哺乳類細胞で使用されてきました。Ｔｅｔシステムには、「薬剤」を添加することにより遺伝子発現をオンにするＴｅｔ－ＯＮシステムと、「薬剤」存在下では遺伝子発現がオフではあるが「薬剤」を除去することにより遺伝子発現をオンにするＴｅｔ－ＯＦＦシステムがあります。それらのシステムでは、「薬剤」と結合するタンパク質（ＴｅｔＲなど）が遺伝子発現を調節する遺伝子配列（ＴＲＥ配列）に結合すると、その下流にある遺伝子の発現をオンにすることができます。そのためＴＲＥ配列の後に配置する遺伝子を変えることによって、その遺伝子発現のオン／オフを薬剤の投与／非投与によって制御することができます。しかし、Ｔｅｔシステムでは、培養細胞あるいは生体内における「薬剤」の残留時間が長く、任意のタイミングで完全に除去することが難しいため、厳密な遺伝子発現制御が困難でした。さらに、Ｄｏｘは細胞培地内や体内で拡散するため、Ｔｅｔシステムが機能する生体内での領域を空間的に制御することも困難でした。

本研究者らは、光の持つ時間的・空間的分解能の良さに着目し、「光」によって活性制御が可能なＴｅｔシステムを開発できれば、より厳密な遺伝子発現の制御が可能になると考えました。そこで、シロイヌナズナ由来の光受容体であるＣｒｙ２と、その結合パートナーであるＣＩＢ１に着目しました。これらは青色光照射によってヘテロ二量体（異なる２種の単量体が結合した分子）を形成します。すでに、哺乳類細胞において、Ｃｒｙ２－ＣＩＢ１システム^注６）を利用して「青色光」により内在性の遺伝子発現を制御できるＬＩＴＥｓという手法が開発されていましたが、この手法は遺伝子発現を制御したい遺伝子ごとに特別な因子（転写活性因子（ＴＡＬＥｓ））を調製しなければならず、一般的には汎用性が低い手法でした。また、フィトクロムタンパク質を利用して、「赤色光」により制御可能なＴｅｔシステムが報告されていますが、長時間の光照射を必要とするため、短時間で遺伝子発現を制御することは困難でした。そのため、本研究チームでは、Ｃｒｙ２－ＣＩＢ１とＴｅｔシステムを組み合わせて、幅広い遺伝子に対してより簡便に使用できるような遺伝子発現の光制御システムの開発に取り組んできました。

＜研究手法・成果＞

本研究者らは、ヒト由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、「青色光」により効率良く駆動するＴｅｔシステムの開発を試みました。まず、これまでに報告されていて光依存的に二量体の形成が誘導されるさまざまな２種類のタンパク質（Ｃｒｙ２とＣＩＢ１、ＴＵＬＩＰｓ、Ｍａｇｎｅｔ、ｏＬＩＤとｉＬＩＤの組み合わせなどの光作動性モジュール）とＴｅｔシステムを組み合わせることを検討しました。例えば、ＣＩＢ１と転写因子（ＴｅｔＲ）のＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質をコードする遺伝子発現カセット（コンストラクト）を作製し、一方でＣｒｙ２とｐ６５タンパク質由来の転写活性化ドメイン（ｐ６５ ＡＤ）との融合タンパク質をコードする遺伝子発現カセット（コンストラクト）を作製しました。光照射により両者の結合がうまくいくと、ＴｅｔＲはＴＲＥ配列に結合し、ＴＲＥ配列の下流に人工的に配置した遺伝子（ホタルの発光タンパク質ルシフェラーゼなど）の発現がオンになる状態を観察できるような実験系を利用しました。また、光作動性モジュールの配置や組み合わせを変えて、多数のスクリーニングを繰り返した結果、哺乳類細胞で機能したのは、Ｃｒｙ２－ＣＩＢ１を使用した場合のみでした。さらに、Ｃｒｙ２とＣＩＢ１あるいはそれぞれの変異体の配置、安定性、細胞内局在、リンカー配列、アミノ酸置換などを詳細に検討して最適化しました。

このうち、最も効率良く機能するものを、ＰＡ－Ｔｅｔ（Ｐｈｏｔｏ－ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ－Ｔｅｔ）システムと名付けました。このシステムでは、Ｃｒｙ２の変異体であるＣｒｙ２ ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）（Ｃｒｙ２のＰＨＲドメイン中の３４８番目のアミノ酸に置換があるもの）と、ＣＩＢ１の変異体であるＣＩＢＮ（ＣＩＢ１を部分的に欠失させた上で、核移行ドメインに変異導入を行ったもの）を使用しています。この新たに開発したＰＡ－Ｔｅｔシステムは、従来の光感受性Ｇａｌ４／ＵＡＳシステムと比較して、暗所における遺伝子発現誘導が起きにくく、かつ、光に応答して誘導される遺伝子発現レベルは大幅に増加しました。また、従来のＴｅｔシステムと同じく、低分子化合物Ｄｏｘによって活性制御できる性質も保持されていました。

そこで、ＰＡ－Ｔｅｔシステムの特性を調べるために、このシステムを一過性あるいは安定的に発現させた培養細胞を用いて、光強度（光量）やＤｏｘ濃度依存的な遺伝子発現誘導の変化を観察した結果、光量依存的に遺伝子発現を制御できることが分かりました（ＰＡ－Ｔｅｔ－ＯＦＦシステム）。さらに、光量とＤｏｘ濃度の両者の条件を調整して遺伝子発現レベルをより精密に制御できるシステムも構築することができました（図２Ａ、ＰＡ－Ｔｅｔ－ＯＮシステム）。

このシステムでは、光照射の間隔やＴＲＥ配列の下流で発現する遺伝子の安定性を変化させることにより、人工的にさまざまな発現パターンを誘導することができました（図２Ｂ）。また、光が持つ空間分解能の良さを利用して、単一細胞レベルで光照射を行ったところ、標的とした細胞の遺伝子発現のみを制御することにも成功しました（図２Ｃ）。

さらに、培養細胞だけではなく、動物の生体内でもＰＡ－Ｔｅｔシステムは作動することが分かりました。マウス脳内の神経幹細胞（図３Ａ－Ｄ）や神経細胞（図３Ｅ－Ｈ）に対して、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）^注７）やウイルスベクターを用いて脳細胞にＰＡ－Ｔｅｔシステムを導入し、光ファイバーなどにより局所的に光照射を行っても本システムは作動しました。また、ＰＡ－Ｔｅｔシステムを持つ細胞をマウスの皮膚に移殖した場合（図３Ｉ）でも、「光」により遺伝子発現を制御することに成功しました。

以上の結果より、本研究で開発したＰＡ－Ｔｅｔシステムを使用すれば、さまざまな遺伝子発現パターンを創生あるいは操作できることが明らかとなりました。この技術を使用すれば、脳の発生や神経再生の過程で転写因子が示す複雑な遺伝子発現パターンを人工的に操作することができ、その機能的意義を検証できると考えています。将来的にはモデル動物の脳内の神経幹細胞にＰＡ－Ｔｅｔシステムを適応して、発生・幹細胞研究や神経科学研究への貢献を期待しています。

＜波及効果、今後の予定＞

さまざまな細胞の遺伝子発現を「光」や「薬剤」により制御できる技術は、脳内での神経幹細胞の分化制御メカニズムの解明に有用です。また、この技術を用いることで、神経幹細胞の自己複製やニューロンあるいはグリア細胞への分化誘導を光で操作することが可能になるので、脳損傷や神経変性疾患に対する再生医療研究に貢献することが期待されます（図４）。さらに、本研究では、皮膚細胞においてもＰＡ－Ｔｅｔシステムが使用できることが明らかとなりました。このことから、ＰＡ－Ｔｅｔシステムは、神経幹細胞だけではなく、多能性幹細胞（ＥＳ細胞・ｉＰＳ細胞）や造血幹細胞・皮膚幹細胞などの幹細胞でも使用できると期待され、幹細胞研究全体への幅広い波及効果が予想されます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１）テトラサイクリン誘導系（Ｔｅｔ）システム

大腸菌由来のＴｅｔＲ転写因子と、その結合配列であるＴＲＥ（ＴｅｔＯ）配列を用いた遺伝子発現制御システムである。抗生物質テトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）非存在下で、ＴｅｔＲのＤＮＡ結合と転写機能を抑制できるＴｅｔ－ＯＦＦシステムが初めに開発された。その後、ＴｅｔＲへの変異導入により、Ｄｏｘ非存在下ではＴＲＥ配列に結合できず、Ｄｏｘ存在下でＴＲＥ配列に結合して転写活性を持つようになるＴｅｔ－ＯＮシステムが開発された。

注２）ニューロン（神経細胞）

神経系を構成する細胞であり、細胞体・樹状突起・軸索を持つ。脳と脊髄を含む中枢神経系では、ニューロンは軸索末端を介して他のニューロンの樹状突起へと情報を伝達し、神経ネットワークを形成する。

注３）グリア細胞

神経系を構成するニューロンではない細胞の総称。グリア細胞は脳環境の恒常性の維持に寄与していると考えられてきたが、近年ニューロンの活動にも関与していることが示唆されてきた。

注４）転写因子

ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の一群。ＤＮＡ上の転写を制御する領域に結合し、ＤＮＡの遺伝情報をＲＮＡに転写する過程を制御する。

注５）Ｇａｌ４／ＵＡＳシステム

酵母由来のＧａｌ４転写因子と、その結合配列であるＵＡＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いた遺伝子発現制御システムである。転写を活性化させるＧａｌ４タンパク質によって、ＵＡＳ配列下に導入した遺伝子の発現を制御することができる。

注６）Ｃｒｙ２－ＣＩＢ１システム

Ｃｒｙ２はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）が持つクリプトクロムと呼ばれる光受容体。Ｃｒｙ２は青色光照射依存的に構造変化し、同じくシロイヌナズナ由来のタンパク質ＣＩＢ１タンパク質に結合できるようになる。Ｃｒｙ２－ＣＩＢ１システムは、この性質を使用した、光依存的な二量体形成システムである。

注７）エレクトロポレーション法（電気穿孔法）

電気パルスで細胞膜の透過性を上げて、ＤＮＡ（プラスミドなど）などの分子を細胞内に導入する手法である。

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