多様な植物に侵入するペプチドの探索

＜研究の背景＞

細胞膜透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＰＰ）は、核酸やタンパク質などの物質を細胞内へ効率的に輸送する有用なツールです。動物細胞ではすでに多種多様なＣＰＰが開発されており、ドラッグデリバリーシステムなど医療に応用されています。しかし植物細胞では、農業や環境浄化など幅広い分野への応用が期待されているにもかかわらず、現在のところ効率的な細胞内物質輸送に適したペプチドの知見はほとんどありません。

ＣＰＰは数十アミノ酸からなり、脂質二重膜からなる細胞膜を不安定化させ、透過する特性を持っています。また、ＣＰＰは、その化学構造から、リジンやアルギニンを多数持つ「陽イオン性」、極性と非極性の両方のアミノ酸を持つ「両親媒性」、非極性アミノ酸からなる「疎水性」の３種類に大別されます。このような分子特性を持つＣＰＰは、核酸やタンパク質など輸送する物質と複合体を形成することで、エンドサイトーシス^注３）やピノサイトーシス^注４）などにより輸送物質を細胞外から内部へ送達します（図１）。

植物の形質転換には、多くの場合、アグロバクテリウム法^注５）やパーティクルガン法^注６）を用います。しかし、植物種が限定されることや、大型の装置が必要になること、細胞内小器官（オルガネラ）^注７）を特異的に標的化することが困難であることが課題として挙げられています。そこで、多種多様な植物種への物質輸送を可能にするＣＰＰの開発が重要です。そのためには、ＣＰＰの化学特性と透過効率の相関性を詳しく調べ、植物種ごとに最適化されたＣＰＰの開発が必要になります。

＜研究手法と成果＞

共同研究チームはまず、すでに生物物理学、生化学的な知見があり、動物細胞で効果が認められている５５種のＣＰＰライブラリーを作製し、円二色性スペクトル法^注８）などを用いて、その二次構造や機能などの化学特性について調べました。

次に、これらのＣＰＰに蛍光ラベルを施した後、共焦点顕微鏡^注９）による植物細胞膜透過性解析を行いました。はじめにタバコ培養細胞を用いて、細胞内に効果的に侵入する８種類のＣＰＰを同定しました。この８種類のＣＰＰは 二次構造上の共通性はありませんが、リジンに富む配列を共通に持つことが分かりました。しかし、動物細胞では膜透過性が高いＣＰＰが多いのに対し、他のＣＰＰはタバコ培養細胞では膜透過性が低いことが分かりました。これには、植物細胞の膜構造、構成分子や分化の特異性が関係していると考えられます。さらに、一部のＣＰＰでは細胞毒性があったり、核に局在したりすることも分かりました。

次に、タバコ培養細胞の結果を踏まえ、膜透過性の違いにより区分したＣＰＰを選抜し、研究によく用いられるタバコ、トマト、シロイヌナズナ、ポプラ、イネ（図２）を用いて、同様に解析しました。その結果、イネの葉細胞を除く、用いた植物種全てに効果的なＣＰＰとしてＨＰＶ３３Ｌ２－４４５／４６７を含む複数のＣＰＰを同定しました（図３）。また、イネの葉細胞の構造特性との関連性を調べるためにイネカルス^注１０）を用いた解析を行うと、多くのＣＰＰが有効であり、今後の研究材料としての有用性が強く期待されました。本研究を通して、植物種や組織によって、導入効率は大きく異なり、これらに応じてペプチドを最適化することの重要性が明らかになりました。

＜今後の期待＞

本研究では、多様な植物細胞の細胞膜透過に効果的なＣＰＰの知見を得ることに成功しました。これまで植物でのＣＰＰの利用は限定的でしたが、今後は、植物種ごとに最適化されたＣＰＰを開発することで、特殊な機器を必要としない簡便な遺伝子導入やオルガネラ形質転換体作出に寄与すると考えられます。また、ＣＰＰとセンサー物質を化学結合させ、作物の病態や細胞の活性を感知する細胞内マーカーとして、幅広く利用されることも期待できます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１）細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）

１０～１００個程度のアミノ酸からなる、細胞膜を透過できるペプチドの総称。ＣＰＰは、Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅの略。

注２）ドラッグデリバリーシステム

薬物送達システムの総称。組織や細胞、また病変部などへ、直接に適時適量の薬剤などを運搬する方法。このとき、薬剤などの小分子をリポソーム、高分子ミセルやマイクロカプセルなどに包み込んで導入する方法がある。

注３）エンドサイトーシス

細胞膜の外側に存在する物質やタンパク質を細胞内部へ取り込む現象。受容体との結合、被覆小胞形成から内部での輸送、液胞での分解経路からなる。

注４）ピノサイトーシス

エンドサイトーシスと類似の機構で、細胞外の小粒子を細胞内へ取り込む現象。

注５）アグロバクテリウム法

アグロバクテリウムとは、植物の形質転換体の作出に利用されるバクテリアの総称である。このバクテリアの植物細胞への感染機構を利用して、外来の遺伝子を植物の遺伝子に導入する方法。

注６）パーティクルガン法

ヘリウムなどの高圧ガスを用いて、遺伝子をコーティングした金粒子やタングステン粒子を直接、細胞内へ導入する遺伝子組み換え技術。

注７）細胞内小器官（オルガネラ）

細胞内の膜に囲まれた構造体で、それぞれが定められた機能を果たす。具体的には細胞核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞など。

注８）円二色性スペクトル法

外・可視領域を利用した円偏光二色性スペクトルを測定し、タンパク質の二次構造を調べる手法。

注９）共焦点顕微鏡

小さく絞ったレーザー光を走査して画像を取得するレーザー走査型蛍光顕微鏡の１種。蛍光シグナルを検出する際、集光面にピンホールを設置して焦点面由来の光だけを検出するため、深さ方向にもレーザー走査することで３次元的な蛍光像を得ることができる。

注１０）カルス

植物の組織片をオーキシンなどの植物ホルモンを含む培地を用いて培養したときに生じる未分化な細胞塊。その後、適切な条件で培養すると、茎、葉、根などの器官へと再分化し、さらには個体全体の再生を誘導することも可能である。

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