共同発表：日本産ハナガサクラゲより開発！耐酸性緑色蛍光タンパク質Ｇａｍｉｌｌｕｓ～生体内の酸性環境を調査する新技術～

ポイント

ハナガサクラゲの触手から、耐酸性で緑色の蛍光タンパク質Ｇａｍｉｌｌｕｓを開発。
一般的な緑色蛍光タンパク質が酸性環境で蛍光を失うのに対して、Ｇａｍｉｌｌｕｓは酸性環境を含むほぼ全てのｐＨ環境（ｐＨ４．５－９．０）で使用可能。
生体分子の分解・リサイクルを行うオートファジーなど、酸性細胞小器官が関わる未知の生命現象を調べる分子ツールとしての貢献に期待。

大阪大学産業科学研究所の永井健治　教授らの研究グループは、鶴岡市立加茂水族館から提供された日本産ハナガサクラゲから、ｐＨ４．５－９．０の細胞環境で安定して蛍光^注１）する、耐酸性の緑色蛍光タンパク質“Ｇａｍｉｌｌｕｓ”の開発に成功しました。

今回研究グループは、ハナガサクラゲの光る触手から、蛍光タンパク質^注２）をコードする遺伝子を新規に同定し、タンパク質工学を用いて遺伝子改良することで、耐酸性で単量体型、高輝度の緑色蛍光タンパク質Ｇａｍｉｌｌｕｓ（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｉｄ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｆｏｒ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｎｇ　ｓｏｕｒｅｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔの略）を開発しました（図１）。一般によく使われる、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ（オワンクラゲ由来）がｐＨ６．０以下の酸性環境で蛍光を失うのに対して、Ｇａｍｉｌｌｕｓは酸性環境でも安定した蛍光を放ち、細胞内のほぼ全てのｐＨ環境で使用可能です（図２左）。Ｇａｍｉｌｌｕｓの立体構造をＸ線結晶解析法^注３）で決定したところ、一般的なＧＦＰとは異なるトランス型の蛍光発色団^注４）を形成し、この構造が耐酸性メカニズムに寄与することを見いだしました（図１右）。

酸性細胞小器官は、２０１６年のノーベル医学・生理学賞受賞者の大隅良典　博士が発見したオートファジーなど、多くの生命機能に密接に関わっています。しかし、既存の緑色蛍光タンパク質は、低ｐＨで蛍光しないため、酸性細胞小器官内での使用が限られていました。Ｇａｍｉｌｌｕｓを用いることにより、マクロオートファジーにより蛍光タンパク質が細胞質から酸性細胞小器官へリソソーム輸送される過程を観察することが可能になりました（図２右）。将来的には、既存の耐酸性の青色・赤色蛍光タンパク質と組み合わせることで、複数種のタンパク質を別々の色で標識して、同時に追跡することが可能となります。Ｇａｍｉｌｌｕｓは、酸性環境中の未知の生命現象を発見するための基盤技術となり、医学・創薬研究にも大きく貢献すると期待されます。

本研究は、文部科学省科学研究費補助金新学術領域研究「少数性生物学」、「脳構築における発生時計と場の連携」の一環として行われました。

本研究成果は、２０１７年１２月２９日（金）（日本時間）に「Ｃｅｌｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（オンライン）に掲載されます。

本研究は、国立研究開発法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）戦略的創造研究推進事業（ＣＲＥＳＴ）「超解像「生理機能」イメージング法の開発と細胞状態解析への応用」、「異物排出輸送の構造的基盤解明と阻害剤の開発」の一環として行われました。

＜研究の背景＞

細胞内にあるリソソームなどの酸性細胞小器官は、生体分子の修飾・輸送・分解から、細胞死誘導のコントロールなど、生命活動に幅広く重要な役割を担っています。２０１６年のノーベル医学・生理学賞を受賞した大隅良典　博士が発見したオートファジーもその一例です。生体分子はオートファジーにより、リソソームへ輸送され分解・リサイクルされます。

蛍光タンパク質は酸性細胞小器官中の生体分子の機能を調べるための有効なツールの１つです。蛍光タンパク質で細胞内の特定の生体分子を標識してやれば、蛍光からその位置や動態を観察することができます。複数色の蛍光タンパク質を併用することで、複数種の生体分子を異なる色で光らせることができ、それぞれの機能を同時に調べることができます。しかし、現在報告されている蛍光タンパク質の多くは、ｐＨ６．０を下回る酸性環境では消失するといった問題点があります。青・赤色で耐酸性能をもつ蛍光タンパク質はいくつか報告されていますが、細胞観察に有用な耐酸性の緑色蛍光タンパク質の報告はありませんでした。したがって、酸性細胞環境中の複数の生体分子の相互関係を調査するためにも、耐酸性で緑色の蛍光タンパク質が強く求められていました。

＜今後の展開＞

本研究成果により、酸性細胞環境中の未知の生命現象の解明に貢献すると期待されます。たとえば、既存の耐酸性の青・赤色蛍光タンパク質と併用することで、複数種のタンパク質の機能を同時に解析することが可能になります。また、Ｃａ^２＋などの機能分子を検出するセンサーの作成も、将来的に応用可能です。これらのタンパク質・機能分子が関わる新たな疾病メカニズムの発見、また創薬スクリーニングへの貢献が期待されます。

＜参考図＞

図１　Ｇａｍｉｌｌｕｓ作成の概略図

ハナガサクラゲの触手より、蛍光タンパク質の遺伝子をクローニングし、タンパク質工学により明るさや単量体度を改良した。
（ハナガサクラゲは鶴岡市立加茂水族館の奥泉様よりご提供いただいた。）

図２

（左）ｐＨと蛍光タンパク質の蛍光強度の相関図。
（右）ＧａｍｉｌｌｕｓまたはＥＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞の蛍光画像。Ｇａｍｉｌｌｕｓを用いることで、マクロオートファジーによりタンパク質がリソソームへと輸送される過程を、蛍光で観察できるようになった。スケールバー：１０μｍ．

＜用語解説＞

注１）蛍光: 光を吸収し、その光よりも低エネルギー（長波長）の光を放出する物質の性質のこと。Ｇａｍｉｌｌｕｓは青色光（～５００ｎｍ）を吸収し、緑色光（～５２０ｎｍ）を放出する。
注２）蛍光タンパク質: 蛍光を発するタンパク質の総称。２００８年のノーベル化学賞で知られる下村修　博士らが、１９６２年にオワンクラゲから初めて遺伝子を単離し、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）と命名した。
注３）Ｘ線結晶解析法: 結晶化した分子にＸ線を照射し、回折の結果を解析することで、その立体構造を約０．１～１ｎｍの精度で求めることができる手法。
注４）トランス型の蛍光発色団: 蛍光タンパク質中の、実際に蛍光現象に関わる部位を蛍光発色団と呼ぶ。Ｇａｍｉｌｌｕｓの場合、グルタミン・チロシン・グリシンの３アミノ酸から成熟しできた蛍光団のうちの、チロシンの側鎖の向きが、一般の緑色蛍光タンパク質の逆向き（異性型）のトランス型を形成する。

＜論文情報＞

タイトル	“Acid-tolerant monomeric GFP from Olindias formosa”
著者名	Hajime Shinoda, Yuanqing Ma, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai
doi	10.1016/j.chembiol.2017.12.005