ゲノムが増える仕組みを試験管内に再現し、巨大ＤＮＡ増幅技術を開発

ポイント

• 大腸菌ゲノム複製のサイクルを２５種のタンパク質により世界で初めて試験管内で再構成。
• 等温で自律的に複製サイクルが繰り返し、２０万塩基対を超える長鎖環状ＤＮＡを指数増幅。
• 本技術により、これまで大腸菌を用いていたＤＮＡクローニング^注１）を無細胞で簡便に行うことが可能に。

＜野地 博行　プログラム・マネージャーのコメント＞

バイオ産業の市場規模は年々急速に拡大していますが、天然細胞の代謝系に依拠した従来の物質生産法には自ずと限界があり、人工細胞を用いた有用物質の革新的な生産方法の開発が望まれています。ＩｍＰＡＣＴ野地プログラムの「ふえる」プロジェクトでは人工細胞技術の根幹である試験管内人工ゲノム合成法を開発するため、バイオ産業で広く利用されており解析も進んでいる大腸菌のＤＮＡ増幅システムに着目し、簡便で精度の高い長鎖環状ＤＮＡの増幅技術の開発に取り組んできました。本技術開発により、無細胞系のワンポッド反応で長鎖環状ＤＮＡを短時間で指数的に増幅させることが可能となり、今後の合成生物学やバイオ産業の発展に大きく寄与すると期待しています。

＜研究の背景と経緯＞

バイオテクノロジーの基盤をなすＤＮＡ増幅技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がよく知られています。この技術は人為的な温度サイクルにより比較的短いＤＮＡ（遺伝子１個程度）を指数増幅するものです。一方で細胞は、増殖過程において、温度サイクルによらずともゲノム複製のサイクルを幾度も繰り返し、ゲノムという長大なＤＮＡ（大腸菌では約４０００の遺伝子）の正確な増幅を達成しています。そこで我々はこの細胞のもつＤＮＡ増幅の仕組みを試験管内に丸ごと再現することに挑戦しました。

＜研究の内容＞

３０年以上も前にアーサー・コーンバーグ博士らによって大腸菌環状ゲノムの複製機構の試験管内再構成系が構築されました。この再構成系では複製開始配列から両方に複製フォーク^注４）が進行します。我々は、この系に、さらに複製終結および複製後ＤＮＡの分離反応の融合を検討しました。分離反応により、うまく複製後の産物をもとの鋳型と同じ環状単量体ＤＮＡ分子に戻すことができれば、倍加された環状ＤＮＡ分子は引き続き次のラウンドの複製サイクルに突入できるのではないかというアイデアです（図１）。検討を重ね、大腸菌由来の２５種のタンパク質より構成される反応系を構築し、この反応系において環状ＤＮＡ分子の指数的な増幅が導かれていることを検出しました（図２）。この結果は、期待通り複製サイクルが自律的に繰り返され、環状分子が倍々に増えていることを示しています。我々はこの系を「複製サイクル再構成系（Replication Cycle Reaction；ＲＣＲ）」と名付け、ＤＮＡ増幅法として、次のような特徴を持つことを示しました。

• 等温で複製開始配列をもつ環状ＤＮＡ分子が指数増幅し、増幅産物として環状ＤＮＡが得られる
• １分子からの環状ＤＮＡを、わずか３時間で１００億倍以上に増幅可能
• 増幅が頭打ちになっても新たな反応液に継代することで、何世代も増幅を繰り返すことができる
• 複製の正確性はＰＣＲ酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）の約１万倍で、塩基配列エラーはほとんど生じない
• ２０万塩基対を超える巨大な環状ＤＮＡの増幅が可能

つまり、まるで細胞を培養するようにして、環状ＤＮＡ分子を自律的に増殖させることができるようになりました。従来の大腸菌を用いたＤＮＡクローニング技術は、長鎖環状ＤＮＡ調製法として、近年のバイオテクノロジーの発展を支えてきた技術です。一方で、大腸菌内へのプラスミド化した環状ＤＮＡの導入や、菌の培養、プラスミドＤＮＡ抽出など、多くの手間と日数のかかる手法でもありました。今回我々が構築した反応系によって、数時間の保温のみで長鎖環状ＤＮＡを正確に増幅調製することが可能となりました（図３：無細胞クローニング）。細胞を使わない反応であるため、細胞に導入可能なＤＮＡサイズの制約はなく、また細胞毒性を有するＤＮＡ配列も問題なく増幅できます。

バクテリアの中にはカルソネラ・ルディアイのように１６万塩基対という小さなゲノムをもつものが知られています。我々が増幅に成功した２０万塩基対というサイズは、バクテリアレベルの小さなゲノムであれば、ゲノム丸ごとを試験管内増幅できる革新的な技術であることを意味します。

＜今後の展開＞

遺伝情報の増殖は、おそらく原始生命が誕生した頃から継承されてきた生命共通の現象です。本研究はこのような生命の自己複製能の本質的な部分を試験管内に再現したものであり、今後、自律増殖可能な人工細胞などへとつながるものと期待されます。さらに、我々の構築した再構成系はゲノムレベルの長鎖環状DNAの試験管内調製法として優れた特徴を有しており、近年米国を中心に注目を浴びつつある「ゲノム人工合成」の時間短縮とコスト削減に大きく貢献する可能性があります。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） 大腸菌を用いたＤＮＡクローニング

任意のＤＮＡ領域をプラスミドと呼ばれるベクター（運び屋）ＤＮＡに連結し、これを大腸菌細胞内に導入後、大腸菌を培養することにより、当該遺伝子を増幅させる方法。大腸菌宿主を用いるため遺伝子組み換え実験となる。

注２） ゲノム複製サイクル

複製開始、複製フォークの進行、岡崎フラグメント連結、終結、姉妹ＤＮＡ分離、からなるサイクル。

注３） 複製開始配列

大腸菌ゲノム（約５００万塩基対）は環状構造をしており、ｏｒｉＣと呼ばれる複製開始配列（約３００塩基）から両方向に複製フォークが進行する。

注４） 複製フォーク

複製タンパク質複合体が親鎖となるＤＮＡ２重鎖を１本鎖に開裂しながら１本鎖に相補的なＤＮＡを合成していく。この時のＹ字型のＤＮＡ構造のこと。

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