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平成２７年１２月１日

京都大学 ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）
科学技術振興機構（ＪＳＴ）
日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）
大日本住友製薬株式会社

FOP変異型受容体を介して、アクチビンAがBMPシグナルを活性化する
～FOPの異所性骨形成における新たなメカニズムを発見～

ポイント

日野 恭介　共同研究員（京都大学 ＣｉＲＡ／大日本住友製薬株式会社 先端創薬研究所）、池谷 真　准教授（京都大学ＣｉＲＡ）、戸口田 淳也　教授（京都大学 ＣｉＲＡ／再生医科学研究所／医学研究科）らの研究グループは、ＦＯＰ患者さんから作製したｉＰＳ細胞（ＦＯＰ－ｉＰＳ細胞）を分化させて作製したＦＯＰ患者さん由来細胞（ＦＯＰ細胞）を用いて、本来別のシグナルを伝える分子であるアクチビンＡ注１）が、ＦＯＰ細胞ではＢＭＰ注２）シグナルを異常に伝達し、骨軟骨形成を促進することを示しました。

ＦＯＰとは、筋肉や腱、靭帯など本来は骨が出来てはいけない組織の中に異所性骨とよばれる骨が徐々にできる疾患です。原因は、ＢＭＰ受容体であるＡＣＶＲ１注３）の一部が突然変異により変化して、ＢＭＰシグナルを過剰に伝えるためと考えられています。研究グループはＦＯＰ－ｉＰＳ細胞を用いて、本来は別のシグナルを伝えるアクチビンＡが、ＦＯＰ細胞ではＢＭＰシグナルを異常に伝達することを突き止めました。さらにＦＯＰ－ｉＰＳ細胞から作製した間葉系間質細胞注４）を、アクチビンＡ発現細胞と共に免疫不全マウスに移植することで、患者由来細胞を用いた異所性骨形成モデルの作製に世界で初めて成功しました。これらの結果はアクチビンＡ阻害剤がＦＯＰ治療薬の候補となる可能性を示唆しており、異所性骨形成モデルを用いて治療候補薬の効果を生体で検証することが可能となりました。この研究成果は２０１５年１１月３０日午後３時（米国東部時間）に「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国科学アカデミー紀要）」で公開されます。

＜研究の背景＞

ＦＯＰは筋肉や腱、靭帯などの軟部組織の中に異所性骨とよばれる骨組織ができてしまう病気で、２００万人に１人程度の割合で患者さんがいると言われている希少難病の１つです。これまでの研究により、この病気は骨形成を司る増殖因子であるＢＭＰの受容体の１つであるＡＣＶＲ１遺伝子に突然変異が生じて変異型ＡＣＶＲ１へと変化し、ＢＭＰシグナルを過剰に伝えることにより異所性に軟骨が形成され、それが骨になると考えられていますが、発症に至る詳しいメカニズムは分かっていませんでした。

これまでに研究グループは、ＦＯＰ－ｉＰＳ細胞や、変異型ＡＣＶＲ１遺伝子を修復した対照ｉＰＳ細胞（ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳ細胞注５））の作製に成功しています。また、ｉＰＳ細胞から間葉系間質細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ；　ｉＭＳＣ）を経て、軟骨へと分化させる方法も確立しており、ＦＯＰ細胞では軟骨への分化能が促進することを確認していました（参照：ＣｉＲＡプレスリリース２０１５／０３／１３）。

今回は、これらの細胞を用いて、ＦＯＰ細胞でどのようにＢＭＰシグナル伝達が活性化され骨・軟骨形成が促進されるのか、という病態メカニズムに迫りました。これまで、変異型ＡＣＶＲ１にＢＭＰが結合することによりシグナルが過剰に伝達されるという説と、ＢＭＰとの結合に関係なくシグナルが恒常的に伝達されるという説の、２つのメカニズムが提唱されていますが、いずれも観察されている現象を十分説明できるものではありませんでした。そこで研究グループは、ＢＭＰ以外のリガンド注６）が作用してＢＭＰシグナルを伝達するという仮説をたて、検討を行いました。

＜研究結果＞

１．アクチビンＡはＦＯＰ細胞において、異常なＢＭＰシグナル伝達を引き起こす

まず変異遺伝子を修復した細胞では反応せず、ＦＯＰ細胞でのみＢＭＰシグナルを活性化するリガンドのスクリーニングを実施しました。ＦＯＰ－ｉＰＳ細胞およびｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳ細胞から、それぞれ間葉系間質細胞（ＦＯＰ－ｉＭＳＣおよびｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣ）を作製し、ＢＭＰシグナルを検出するルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を導入しました。それらの細胞と、ＴＧＦ－βスーパーファミリー注７）に属するＢＭＰと類似の構造を持つ２７種類のリガンドを反応させ、１６時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定しました。これまでの報告通り、ＢＭＰ６やＢＭＰ７などいくつかのＢＭＰを添加すると、ｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣと比べてＦＯＰ－ｉＭＳＣにおいてＢＭＰシグナルがより活性化されましたが、その比は１．４倍程度でした。これに対して、アクチビンＡを添加するとその比は４倍以上と大きく増大させることが分かりました（図１）。

さらに、ＦＯＰ－ｉＭＳＣにおいて変異型ＡＣＶＲ１をノックダウンすると、ＢＭＰシグナルの活性化が見られず、また変異型ＡＣＶＲ１を別の骨系統細胞で過剰発現させると、アクチビンＡに反応してＢＭＰシグナル活性が高まりました。これらの結果により、アクチビンＡは変異型ＡＣＶＲ１を介して異常なＢＭＰシグナル伝達を引き起こすことが示されました。

２．アクチビンＡにより、ＦＯＰ細胞の軟骨形成が促進された

軟骨への分化におけるアクチビンＡの影響を調べました。ＦＯＰ－ｉＭＳＣとｒｅｓＦＯＰ—ｉＭＳＣから２次元のマイクロマス培養法注８）により軟骨を誘導し７日目に比較したところ、ＦＯＰ細胞ではアクチビンＡ添加で、より大きな軟骨様組織が形成されました（図２）。また、この現象はアクチビンＡ阻害剤で抑えられ（図３）、アクチビンＡの阻害がＦＯＰにおける異所性骨化を抑える新たな治療ターゲットとなる可能性を示しました。

次に、軟骨の成熟度を確認するために、ＦＯＰ－ｉＭＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣを３次元で塊（ペレット）にして培養し、軟骨を誘導しました。アクチビンＡを添加した条件での誘導２１日後には、ＦＯＰ細胞でより成熟した軟骨細胞が見られました（図４）。また、ＦＯＰ－ｉＭＳＣ由来軟骨組織では後期の軟骨マーカー（ＣＯＬ１０Ａ１、ＶＥＧＦＡ、ＭＭＰ１３）の発現が高いことも確認しており、アクチビンＡは軟骨成熟を促進することが分かりました。

さらに、これらの軟骨ペレットを免疫不全マウスの背に移植すると、４週間後、ｒｅｓ－ＦＯＰ細胞由来軟骨ペレットでは骨化がほぼ生じなかった（１／１０匹）のに対して、ＦＯＰ細胞由来軟骨ペレットでは高頻度に骨が形成されました（９／１０匹）。これにより、これらの軟骨ペレットは生体内ではアクチビンＡ刺激なしでも骨化することが分かりました。

３．ＦＯＰ－ｉＰＳ細胞から作製した間葉系間質細胞を用いて、異所性骨形成モデルが作製できた

さらに、ＦＯＰ－ｉＭＳＣまたはｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣと、ドキシサイクリン誘導によりアクチビンＡを発現する細胞を混合して、免疫不全マウスに移植しました。移植６週間後の観察で、ドキシサイクリンを用いてアクチビンＡを誘導した場合にのみ、ＦＯＰ細胞を移植した箇所に異所性骨の形成が認められました（図５）。

＜まとめ＞

本研究では、ＦＯＰ－ｉＰＳ細胞を用いて、本来ＴＧＦ－βシグナルを伝える分子であるアクチビンＡがＦＯＰ細胞ではＢＭＰシグナルを伝え、骨軟骨形成を促進することを明らかにし、このメカニズムがＦＯＰにおける異所性骨化形成に大きく寄与している可能性を示しました。またこの結果は、アクチビンＡ阻害剤がＦＯＰ治療薬の候補となる可能性を示唆します。

さらにＦＯＰ－ｉＰＳ細胞から作製した間葉系間質細胞を、アクチビンＡ発現細胞と共に免疫不全マウスに移植することで、ＦＯＰ患者由来細胞を用いた異所性骨形成モデルの作製に世界で初めて成功しました。このモデルを用いることで、ＦＯＰに対する薬剤の効果を生体で検証することが可能となり、治療薬のスクリーニングに役立つことが期待されます。

＜参考図＞

図１　ＢＭＰシグナルを促進するＦＯＰ細胞特異的リガンドのスクリーニング

ＢＭＰに類似の構造をもつＴＧＦ－βスーパーファミリーのうち、アクチビンＡで処理すると、ＦＯＰ細胞のみでＢＭＰシグナルが活性化することが分かりました。
（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．，　Ｎ＝３－４，　＊＊＊　Ｐ＜０．０１）

図２　ＦＯＰ細胞およびｒｅｓＦＯＰ細胞から分化誘導した軟骨様組織

ＦＯＰ－ｉＭＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣから分化誘導７日後の軟骨様組織の様子を示しています。軟骨様組織のうち軟骨基質がアルシアン・ブルー染色にて青く染まっています。アクチビンＡの添加により、ｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣと比較してＦＯＰ－ｉＭＳＣはより大きな軟骨様組織を形成しました。
（スケールバー：２００µｍ）

図３　ＦＯＰ細胞から軟骨様組織誘導におけるアクチビンＡ阻害剤の影響

アクチビンＡによるＦＯＰ細胞の軟骨様組織形成は、アクチビンＡ阻害剤により抑制されました。
（アルシアン・ブルー染色、スケールバー：２００µｍ）

図４　３次元軟骨ペレット培養による軟骨様組織

ＦＯＰ－ｉＭＳＣとｒｅｓＦＯＰ－ｉＭＳＣからアクチビンＡを添加した条件下での分化誘導２１日後の軟骨様組織の様子を示している（アルシアン・ブルー染色）。ＦＯＰ細胞では、細胞質が大きく成熟した軟骨細胞が観察されました。
（スケールバー：上段２００µｍ、下段５０µｍ）

図５　ＦＯＰ－ｉＰＳ細胞由来間葉系間質細胞を用いた異所性骨モデル

ＦＯＰ細胞を移植しアクチビンＡを誘導した場合のみ、異所性骨が形成されました。

＜用語解説＞

注１） アクチビンＡ
ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　β；　トランスフォーミング増殖因子β）ファミリーに属するタンパク質で、細胞増殖や分化など多くの生理機能を調節する作用を持つ。
注２） ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ；　骨形成因子）
骨組織や軟骨の分化を誘導、促進するタンパク質。ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する。
注３） ＡＣＶＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ－１）
ＢＭＰ受容体の一部を構成するタンパク質で、ＢＭＰと結合することにより骨形成のシグナルを伝達する。アクチビンＡとは、結合はするがシグナルは伝えないことが知られていた。ＦＯＰではＡＣＶＲ１遺伝子の変異により、ＡＣＶＲ１タンパク質の２０６番目のアルギニンがヒスチジンに変化し、アクチビンＡとの結合で本来伝えないはずのＢＭＰシグナルを伝えていた。
注４） 間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ）
骨・軟骨・脂肪細胞などといった間葉系の細胞に分化する能力を持った間質（結合組織）の細胞。本報では、ｉＰＳ細胞から作製したものをｉＭＳＣ（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）としている。
注５） ｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳ細胞
ＦＯＰ患者さんから作製した疾患ｉＰＳ細胞のゲノム中の原因変異を修復した細胞。このｒｅｓＦＯＰ－ｉＰＳ細胞は、修復した変異以外は、もとの患者さん由来ｉＰＳ細胞と、同じ遺伝情報を持っているため、ＦＯＰ変異やそれに関連する病気のメカニズムを調べる上で、より厳密な対照細胞となる。
注６） リガンド
特定の受容体に特異的に結合する物質。
注７） ＴＧＦ－βスーパーファミリー
ＴＧＦ－β、ＢＭＰ、アクチビンなど構造上類似した因子で構成される集合体の総称。スーパーファミリーには他に、免疫グロブリンスーパーファミリー、核ホルモン受容体スーパーファミリーなどが存在する。
注８） マイクロマス培養法
細胞を高濃度で調製し、培養皿上に滴状に播種することで作製される高密度の細胞塊をマイクロマスとよび、その状態で培養する方法をマイクロマス培養法とよぶ。軟骨分化の際に用いられる。

＜論文名と著者＞

＜本研究への支援＞

本研究は、下記機関より資金的支援を受けて実施されました。

＜お問い合わせ先＞

＜研究内容およびCiRAに関すること＞

京都大学 iPS細胞研究所(CiRA) 研究支援部門 国際広報室
野口 悦（ノグチ エツ）
〒606-8507 京都府京都市左京区聖護院川原町53
Tel：075-366-7005　Fax： 075-366-7185
E-mail：

＜研究内容および大日本住友製薬に関すること＞

大日本住友製薬株式会社 コーポレート･コミュニケーション部
〒541-0045 大阪府大阪市中央区道修町2-6-8
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