平成２６年１２月１９日
大阪大学
科学技術振興機構（ＪＳＴ）
健康人における自己免疫疾患抑制のしくみ
大阪大学 免疫学フロンティア研究センターの前田 優香 博士、西川 博嘉 特任准教授、坂口 志文 教授らの研究グループは、ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞注１）が自己免疫反応（自己免疫疾患）を回避するために自己に反応するＣＤ８陽性Ｔ細胞に安定的な免疫不応答状態（アネルギー）を誘導することを明らかにしました。また従来フェノタイプが明らかにされてこなかったアネルギー細胞が持つ特徴的なフェノタイプを明らかにし、健康人の体内に自己に反応するＣＤ８陽性Ｔ細胞がアネルギー状態注２）で存在し、自己免疫応答を抑制していることを同定しました（図）。
本研究は、独立行政法人 科学技術振興機構（ＪＳＴ）の戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）「炎症の慢性化機構の解明と制御に向けた基盤技術の創出」研究領域（宮坂 昌之 研究総括）における研究課題「制御性Ｔ細胞による慢性炎症制御技術の開発」（研究代表者：坂口 志文）の一環として行われました。
免疫系は、ウィルスなどの外来抗原に対して反応し排除しますが、自己に対しては免疫応答を起こしません（免疫自己寛容）。自己に対して免疫応答を起こさないという免疫系の原則は、胸腺での自己に対して反応するＴ細胞の排除（中枢性免疫寛容注３））と末梢での自己に対するＴ細胞に対する免疫不応答性（アネルギー）の誘導（末梢性免疫寛容）によって成り立っています。制御性Ｔ細胞 （Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ）は、自己に反応するＴ細胞の活性化を抑制することで自己免疫応答（自己免疫疾患）が起こるのを阻止しています。しかしながら、制御性Ｔ細胞がどのように自己に反応するＴ細胞を安定的に長期間にわたり抑制しているか、またそれらの抑制された細胞は生体内でどのような特徴を持っているのかなど不明な点が多く残されていました。今回の研究で、ヒト検体を用いて制御性Ｔ細胞が自己に反応するＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗原刺激に不応性（アネルギー）状態にし、特徴的なフェノタイプを誘導することが明らかになり、末梢性免疫寛容での制御性Ｔ細胞の役割の重要性がさらに明確になりました。
自己に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の免疫不応答（アネルギー）状態が破綻すると、自己免疫疾患を引き起こします。一方がん免疫においては、有効ながん免疫療法のためにがん抗原（多くが自己抗原である）に対する免疫不応答（アネルギー）状態を克服し、強い免疫応答を引き起こす必要があります。よって免疫不応答（アネルギー）状態の理解は、様々な免疫応答をコントロールする上で極めて重要であると考えられます。免疫不応答（アネルギー）状態の重要性は長年に渡り理解されてきたものの、アネルギー状態のＴ細胞のフェノタイプなど実態に対する理解が不十分で、治療等への応用が難しいと考えられてきました。
本研究成果により、制御性Ｔ細胞が自己に反応するＣＤ８陽性Ｔ細胞に免疫不応答（アネルギー）状態を誘導し、長期間にわたる免疫寛容を成立させることが示されました。また自己免疫疾患ではこれらの自己反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の免疫不応答（アネルギー）状態が破綻していました。よって、制御性Ｔ細胞を用いて自己に反応するＣＤ８陽性Ｔ細胞に免疫不応答（アネルギー）状態を付与することで自己免疫疾患に対する新たな治療法開発につながると考えられます。加えて免疫不応答（アネルギー）状態を克服する手法を開発することでがん免疫療法など広範な免疫治療にも応用可能であると考えられます。
研究グループは、まず制御性Ｔ細胞がメラノサイト自己抗原（Ｍｅｌａｎ－Ａ）特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化時にどのような影響を与えるかを健康人末梢血単核球（以下ＰＢＭＣ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで検討した。健康人ドナー由来のＰＢＭＣからＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ２５強陽性ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞およびＴ細胞除去ＰＢＭＣ（抗原提示細胞（以下ＡＰＣ））を分離した。ＣＦＳＥラベルしたＣＤ８陽性Ｔ細胞と自己抗原（Ｍｅｌａｎ－Ａ）を提示させたＡＰＣを共培養し、Ｍｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導した。制御性Ｔ細胞を様々な比率で添加したところ、制御性Ｔ細胞の存在比率に依存してＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞誘導率が低下した。さらに重要なことに、誘導されたＭｅｌａｎ－Ａ抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞分裂が１回で停止することを見出した（図１）。また、制御性Ｔ細胞により抑制され、細胞分裂が１回で停止した細胞群は、制御性Ｔ細胞非存在下で誘導した活性化Ｍｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞に比べて、Ｍｅｌａｎ－Ａ抗原に対するＴ細胞レセプターがｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙであった。また２次的抗原刺激に対してサイトカイン産生や細胞増殖を示さず、アネルギー状態であった（図２）。次にアネルギー状態のＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分子発現を網羅的に解析したところ、特徴的なフェノタイプを有していることが明らかになった。特に細胞表面分子発現に着目したところ、ナイーブフェノタイプ（ＣＣＲ７注４）＋ＣＤ４５ＲＡ＋） でありながら、免疫抑制分子（ＣＴＬＡ－４＋ ＰＤ－１＋）を発現し、特にＣＴＬＡ－４注５）＋ＣＣＲ７＋により厳密に定義されることが示された（図３）。さらに、健康人の末梢血中にも自己抗原に対してアネルギー状態の自己反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞注６）が存在するのかをｅｘ ｖｉｖｏで検討した。メラノサイト自己抗原Ｍｅｌａｎ－Ａに対する反応が過剰に活性化している自己免疫疾患、白斑症の検体を用いることで本メカニズムの免疫自己寛容での重要性を検討した。健康人においては自己反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞がアネルギー状態で存在していたが、白斑症患者ではＣＴＬＡ－４＋ＣＣＲ７＋ フェノタイプを示す細胞が認められなくなり、アネルギー状態が破綻していることが示された（図４）。
以上より、制御性Ｔ細胞は自己抗原特異的Ｔ細胞の反応を抑制し、特徴的なアネルギー状態に陥らせることで、長期の免疫寛容を誘導していることが明らかになった。またこれらのアネルギー状態の細胞はＣＴＬＡ－４＋ ＣＣＲ７＋により定義されることが明らかになった。
健康人ＰＢＭＣから分離したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）にＣＦＳＥラベルし、Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉｇｈ ＣＤ４＋）を各々の比で混合し、Ｍｅｌａｎ－Ａ抗原を提示させたＡＰＣと共培養しＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導した。Ｔｒｅｇ非存在下ではＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が効率的に誘導され、細胞分裂を繰り返した（ａ）。一方、Ｔｒｅｇ存在下ではＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞誘導が低下し、細胞分裂が１回で停止する細胞群（ｂ）が認められた。
Ｔｒｅｇの存在下で細胞分裂が１回で停止したＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｂ）は、Ｍｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ａ）に比較してテトラマー染色強度が低く（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔ細胞レセプターを持つ）、アネルギー状態（低細胞分裂能、低サイトカイン産生能）であり、２次刺激後もアネルギー状態を維持していた。
Ｔｒｅｇ存在下で誘導されたＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ非存在下で誘導されたＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞とは異なる細胞表面の表現型を示し、特にＣＣＲ７／ＣＴＬＡ－４陽性で定義された。
健康人ＰＢＭＣでも自己抗原Ｍｅｌａｎ－Ａ特異的な自己反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在が確認された。またこの細胞群はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ存在下で誘導された細胞と同じくアネルギー状態であった。メラノサイトに対する免疫寛容が破綻している白斑症（Ｖｉｔｉｌｉｇｏ）患者のサンプルを用いて検討したところ、白斑症ではＭｅｌａｎ－Ａ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞はｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔ細胞レセプターを持ち、ＣＴＬＡ－４＋ＣＣＲ７＋のアネルギー状態が破綻していた。
Yuka Maeda, Hiroyoshi Nishikawa, Daisuke Sugiyama, Danbee Ha, Masahide Hamaguchi, Takuro Saito, Megumi Nishioka, James B. Wing, Dennis Adeegbe, Ichiro Katayama and Shimon Sakaguchi
“Detection of self-reactive CD8+ T cells with an anergic phenotype in healthy individuals”
Science
doi: 10.1126/science.aaa1292
大阪大学 免疫学フロンティア研究センター（ＷＰＩ－ＩＦＲｅＣ） 実験免疫学 特任准教授
西川 博嘉 （ニシカワ ヒロヨシ）
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川口 貴史（カワグチ タカフミ）
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