ポイント
- 卵子に多量にある異型ヒストンＴＨ２ＡとＴＨ２ＢがｉＰＳ細胞作製を促進
- 異型ヒストンを用いたｉＰＳ細胞作製は、核移植に似たメカニズムを介する
- 異型ヒストンは受精後の父方遺伝子の活性化に関与
理化学研究所（理研、野依 良治 理事長）は、アミノ酸配列が通常のヒストンと異なる「異型ヒストン注１）」をｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）注２）の作製に用いると、核移植注３）に似たメカニズムを介して、ｉＰＳ細胞の作製効率が約２０倍上昇することを明らかにしました。これは、理研 石井分子遺伝学研究室の品川 敏恵 専任研究員と石井 俊輔 上席研究員、および理研 バイオリソースセンター、理研 放射光科学総合研究センター、東京大学、九州大学、筑波大学による共同研究グループの成果です。
京都大学の山中 伸弥 教授らにより、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に多く発現する４つの転写因子（山中因子）を体細胞に発現させると、体細胞が初期化（リプログラミング）され、ｉＰＳ細胞が作製できることが示されました。しかし、ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞に比べ多くのタイプの細胞に分化する能力（多分化能）に劣ることが課題となっています。一方、核移植によるクローンの作製は、山中因子とは異なるリプログラミング因子が卵子に存在することを示唆しています。しかし、卵子のリプログラミング因子の実体には不明な点が多くあります。
共同研究グループは、ヒストンが遺伝子発現に重要な役割を果たすことから卵子のリプログラミング因子の候補として卵子内に多量に存在する「ＴＨ２Ａ」と「ＴＨ２Ｂ」の２つの異型ヒストンに注目しました。これらの因子と山中因子を用いてｉＰＳ細胞を作製した結果、ｉＰＳ細胞の作製が山中因子だけの場合に比べて早く進み、かつ効率が約２０倍上昇しました。ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを用いたｉＰＳ細胞作製について解析したところ、核移植に似たメカニズムが働いていることが示されました。
今回の成果から、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂは、核移植とｉＰＳ細胞作製を橋渡しするものと考えられます。核移植では全能性細胞注４）が形成されるため、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを用いることで、より完全な多分化能を持つｉＰＳ細胞作製につながると期待できます。
本研究成果は、科学技術振興機構の戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）「胚細胞ヒストンによるリプログラミング機構」（研究代表者：石井 俊輔）の助成を受けており、米国の科学雑誌『Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ 』２０１４年２月６日号に掲載されます。
１．背景
京都大学の山中 伸弥 教授らにより、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に多く発現する山中因子と呼ばれる４つの転写因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）を体細胞に発現させると、体細胞が初期化（リプログラミング）され、ｉＰＳ細胞が作製できることが示されました。しかしｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞に比べると多くのタイプの細胞に分化する能力（多分化能）に劣り、ＥＳ細胞のような完全な多分化能を持つｉＰＳ細胞作製が課題となっています。
体細胞のリプログラミングを最初に実証したのが、核移植によるクローンの作製です。この方法では、体細胞の核を取り出し、核を取り除いた未受精卵内に移植することによって、核内の遺伝子発現パターンが未分化な細胞のパターンにリプログラムされます。核移植ではクローン個体ができることから、完全な多分化能を持つ細胞が作製されます。核移植は、山中因子とは異なるリプログラミング因子が卵子に存在することを示していますが、そのリプログラミング因子の実体については不明な点が多くあります。これまで共同研究グループは、卵子に多く存在する、どの因子がリプログラミングに関与するかを研究してきました、今回さらに研究を進め、卵子に多量に存在する異型ヒストンによるリプログラミングおよびｉＰＳ細胞作製の効率化を解析しました。
２．研究手法と成果
１）卵子に多量に存在する異型ヒストンがｉＰＳ細胞作製を促進
共同研究グループは、ヒストンというタンパク質が遺伝子発現に重要な役割を果たすことから卵子のリプログラミング因子の候補として２つの異型ヒストン「ＴＨ２Ａ」と「ＴＨ２Ｂ」に注目しました。ヒストンはＤＮＡを巻き付けてヌクレオソーム注１）という構造を形成し、遺伝子の発現を制御しています（図１）。ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂは、通常のヒストンであるＨ２Ａ、Ｈ２Ｂとアミノ酸配列が１０％程度異なり、卵子に多く存在します。
共同研究グループは、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを山中因子と一緒に体細胞で発現させてみました。その結果、ｉＰＳ細胞の作製が山中因子だけの場合に比べ、より早く進み、かつ効率が約２０倍上昇しました（図２）。また、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを用いると、山中因子のうちＯｃｔ３／４とＫｌｆ４だけで、ｉＰＳ細胞を作製できることを見出しました（図３）。山中因子だけの場合に比べて高効率でｉＰＳ細胞が作製できる理由として、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを含むヌクレオソームは、通常のヌクレオソームに比べ緩い構造を取り、転写が誘導され易いからだと推定できます（図４）。
２）異型ヒストンを用いたｉＰＳ細胞作製は、核移植に似たメカニズムを介する
核移植によるクローン作製は大変効率が低いのですが、「Ｘ染色体不活性化に関与するＸｉｓｔ ＲＮＡ欠損細胞の核を用いると、効率が良くなること」が、理研 バイオリソースセンター 遺伝工学基盤技術室の小倉 淳郎 室長らのグループにより２０１０年に報告されています＊）。ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを用いたｉＰＳ細胞の作製の場合にも、Ｘｉｓｔ ＲＮＡ欠損細胞を用いると、ｉＰＳ細胞作製効率が上がることが分かりました。これは、異型ヒストンを用いたｉＰＳ細胞作製は、核移植に似たメカニズムで起こっていることを示しています。これらのことからＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂは、核移植とｉＰＳ細胞作製を橋渡しするものと考えられます（図５）。
３）異型ヒストンは受精後の父方遺伝子の活性化に関与
共同研究グループは、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂを欠損させた変異マウスを作製し、発生過程の解析を行いました。その結果、ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂは受精卵に伝わり、受精後の父方遺伝子の活性化に関与し、初期発生に重要な役割を果たすことが示されました（図６）。この結果は、核移植によるクローン作製が発生過程と類似のプロセスを経るという考えと一致します。
＊）理研プレスレリース「マウス体細胞クローンの産子出生効率が１０倍近くも改善」（２０１０年９月１７日）
http://www.riken.jp/pr/press/2010/20100917/
３．今後の期待
核移植によるクローニングでは全能性細胞が形成されるので、卵子特異的なリプログラミング因子の利用は、より完全な多分化能を持つｉＰＳ細胞作製につながると期待できます。
＜参考図＞
図１ ヒストン、ヌクレオソーム、ＤＮＡの関係
Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の４種類のヒストンが２つずつ集まってヒストン八量体を形成し、この八量体の周りにＤＮＡが巻き付き、ヌクレオソームという構造になる。
図２ 異型ヒストンによるｉＰＳ細胞作製の促進
- 左：２つの異型ヒストンを山中４因子（ＯＳＫＭ）と一緒に発現させると、ｉＰＳ細胞作製が約１０倍促進された。さらにヒストンをヌクレオソームに運ぶ役割を持つヒストンシャペロン、ヌクレオプラスミン（Ｐ－Ｎｐｍ）、を一緒に加えると、ｉＰＳ細胞作製が約２０倍促進された。
- 右：２つの異型ヒストン、ヌクレオプラスミンを加えると、山中４因子（ＯＳＫＭ）だけの場合に比べ、より短時間でｉＰＳ細胞が形成された。
図３ 異型ヒストンを用いて作製したｉＰＳ細胞とこのｉＰＳ細胞で作製したマウス
- 左：ＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂ、そして山中因子のうちＯｃｔ３／４とＫｌｆ４だけを用いて作製したｉＰＳ細胞。
- 右：右上は、このｉＰＳ細胞を用いて作製したキメラマウス。左下は、キメラマウスから生まれたマウス（左下）。このｉＰＳ 細胞が全ての組織に分化する能力を持つことを示している。
図４ ＴＨ２Ａ／ＴＨ２Ｂを含むヌクレオソームの構造モデル
ＴＨ２Ａ／ＴＨ２Ｂを含むヌクレオソームの構造モデルを作製し、通常のヒストンＨ２Ａ／Ｈ２Ｂを含むヌクレオソームの構造と比較すると、前者は不安定な構造を取ることが示唆された。これにより、ＴＨ２Ａ／ＴＨ２Ｂを含むヌクレオソームは緩い構造を取り、転写を誘導し易いと推定される。
図５ 異型ヒストンＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂによる核移植とｉＰＳ細胞作製の橋渡し
卵子に多く存在する異型ヒストンＴＨ２ＡとＴＨ２ＢがｉＰＳ細胞作製を促進することが示された。これらの異型ヒストンは核移植とｉＰＳ細胞作製の橋渡しをするものと考えられる。
図６ 受精後の父方遺伝子の活性化
精子中では、ＤＮＡはヒストンの代わりにプロタミンに巻き付き、よりコンパクトに折り畳まれている。精子と卵子が受精してできる受精卵では、精子由来の父方遺伝子は雄性前核に存在し、この固い構造が解きほぐされるが、そのメカニズムはまだ不明な点が多い。今回の実験により、異型ヒストンＴＨ２ＡとＴＨ２Ｂが受精卵に伝わり、受精後の父方遺伝子の活性化に関与し、初期発生に重要な役割を果たすことが示された。
＜用語解説＞
- 注１）異型ヒストン、ヌクレオソーム
- ヒストンはＤＮＡを巻き付けて、細胞核内にコンパクトに納める役割を果たすタンパク質。ヒストンにはＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の５種類があり、このうちＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の４種類（コアヒストンと呼ばれている）が２つずつ集まってヒストン八量体を形成し、この八量体の周りにＤＮＡが巻き付きヌクレオソームという構造になる。ヌクレオソームは、全ての真核生物における共通構造（クロマチン）の構成単位である（図１参照）。異型ヒストン（ヒストンバリアントとも呼ばれる）は、通常のヒストンとはアミノ酸配列が少し異なる。
- 注２）ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）
- 体細胞に数種類の遺伝子を導入して作製された細胞で、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）のように多くの細胞に分化できる多分化能と、自己複製能を有する。京都大学の山中 伸弥 教授らのグループにより最初に作製された。
- 注３）核移植
- 動物の体細胞核を未受精卵に移植することによりクローンを作成する方法。核移植による最初のクローンは、１９６２年にケンブリッジ大学（英国）のジョン・ガードン 博士によりアフリカツメガエルから作られた。１９９７年には、ロスリン研究所（スコットランド）のイアン・ウィルムット 博士らによってクローン羊ドリーが作られ、１９９８年には、ハワイ大学の柳町 隆造 教授らによって、マウスからクローンが作製された。
- 注４）全能性細胞
- あらゆる細胞に分化することができる、つまり完全な１個体を形成できる能力を持つ細胞。体を形成する３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）と共に、胎盤のような胚体外組織に分化する能力を持つ。動物では受精卵とその後に数回分裂した状態の細胞が全能性を有する。一方ＥＳ細胞は、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力を持つが、胎盤のような胚体外組織には分化できないため、多能性細胞と呼ばれる。
＜原論文情報＞
Shinagawa T, Takagi T, Tsukamoto D, Tomaru C, Huynh LM, Sivaraman P, Kumarevel T, Inoue K, Nakato R, Katou Y, Sado T, Takahashi S, Ogura A, Shirahige K, Ishii S.
“Histone Variants Enriched in Oocytes Enhance Reprogramming to Induced Pluripotent Stem Cells”,Cell Stem Cell 14, 2014
doi: 10.1016/j.stem.2013.12.015
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