平成２５年１１月１日
京都大学
科学技術振興機構（ＪＳＴ）
京都大学の影山 龍一郎 教授（ウイルス研究所・ｉＣｅＭＳ）、今吉 格 特定准教授（白眉センター・ウイルス研究所）らの研究グループは、神経幹細胞の多分化能と細胞分化制御において、分化運命決定因子が周期的に発現していることが重要であることを発見しました。この知見をもとに、マウスの神経幹細胞の増殖と神経細胞への分化を、光照射にて人工的に制御する技術を開発しました。
これらの研究成果が、「Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ」に掲載されます。
なお、本研究は科学技術振興機構（ＪＳＴ） 戦略的創造研究推進事業（ＣＲＥＳＴ）、基盤研究（Ａ）、若手研究（Ａ）、新学術領域研究「大脳新皮質構築」、武田財団の支援を受けました。
本成果は、以下の事業・プロジェクトによって得られました。
戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）
| 研究領域 | 「生命動態の理解と制御のための基盤技術の創出」 （研究総括：山本 雅 沖縄科学技術大学院大学 教授） |
|---|---|
| 研究課題名 | 「細胞増殖と分化における遺伝子発現振動の動態解明と制御」 |
| 研究代表者 | 影山 龍一郎（京都大学 ウイルス研究所 教授） |
神経幹細胞は、自己複製を行うことができ、かつ脳を構成する主要な３種類の細胞であるニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生み出す多分化能を持つ（図１）。神経幹細胞の自己複製と細胞分化制御機構の解明は、脳神経系の発生機構の解明につながるだけでなく、脳損傷や神経変性疾患に対する再生医療の実現に向けた基盤的知識になる。しかし、自己複製能（分化することなく、自分のコピーを作ることができる）と、多分化能（様々な細胞に分化できる）という全く異なる能力をどのようなメカニズムで神経幹細胞は保持しているのかは不明であった。また、神経幹細胞が細胞分化を行う際に、ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトという３種類の選択肢の中から、どのように１つの選択肢を選んで分化していく（細胞分化運命決定）のかについてもよくわかっていなかった。
神経幹細胞の自己複製と細胞分化はｂＨＬＨ型転写因子によって制御されている。神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイト分化を制御するＨｅｓ１、ニューロン分化を制御するＡｓｃｌ１、オリゴデンドロサイト分化を制御するＯｌｉｇ２という３種類のｂＨＬＨ型転写因子が重要な働きを担っていることが知られている。しかし、Ｈｅｓ１がどのようなメカニズムで幹細胞の未分化性維持とアストロサイト分化という相反する２つの機能を発揮するのかよくわかっていない。また、Ａｓｃｌ１やＯｌｉｇ２は、ニューロン分化とオリゴデンドロサイト分化以外に、神経幹細胞の増殖・維持にも重要であることが知られているが、この相反する機能をどのように制御しているのかも不明である。本研究では、ホタルの発光たんぱく質であるルシフェラーゼとｂＨＬＨ型転写因子の融合たんぱく質が発現するような遺伝子改変マウスを作製し、ｂＨＬＨ型転写因子の発現動態を解析した。Ｈｅｓ１、Ａｓｃｌ１、Ｏｌｉｇ２の３種類のｂＨＬＨ型転写因子について、ルシフェラーゼとの融合たんぱく質の発現動態を観察・解析した。
顕微鏡システムや画像解析法の至適化により、単一細胞レベルで、細胞分化運命決定因子であるｂＨＬＨ型転写因子たんぱく質のリアルタイムイメージングに成功した。その結果、神経幹細胞においてＨｅｓ１、Ａｓｃｌ１たんぱく質は２～３時間周期で、Ｏｌｉｇ２たんぱく質は５?８時間周期で周期的に発現（発現振動）していることが明らかになった（図２）。さらに、Ｈｅｓ１、Ａｓｃｌ１、Ｏｌｉｇ２のいずれかを欠損した神経幹細胞では細胞増殖が減少していたことから、ｂＨＬＨ型転写因子が発現振動を繰り返すことによって神経幹細胞の細胞分裂を促進することが示唆された。
次に、神経幹細胞に細胞分化を誘導して、Ｈｅｓ１、Ａｓｃｌ１、Ｏｌｉｇ２たんぱく質の発現動態をリアルタイムイメージングにて解析した。その結果、ニューロン分化の際にはＡｓｃｌ１が、アストロサイト分化の際にはＨｅｓ１が、オリゴデンドロサイト分化の際にはＯｌｉｇ２がそれぞれ蓄積することが明らかになった（図３）。神経幹細胞からどれかの細胞種に分化運命決定が行われる際には、発現振動を繰り返していたＨｅｓ１、Ａｓｃｌ１、Ｏｌｉｇ２たんぱく質のどれか１種類の発現レベルが上昇し、他の２種類のたんぱく質の発現が消失した。
ルシフェラーゼとｂＨＬＨ型転写因子の融合たんぱく質の発現動態の観察結果から、Ｈｅｓ１、Ａｓｃｌ１、Ｏｌｉｇ２などの細胞分化決定因子は、神経幹細胞にもすでに発現しており、発現振動を繰り返すことで神経幹細胞の増殖を促進すると考えられた。一方、細胞分化誘導時にはどれか１種類のｂＨＬＨ因子の発現が上昇し、細胞分化を促進することが明らかになった。神経幹細胞は、複数の細胞分化決定因子をオシレーションさせることで、多分化能を備えつつも未分化性を保持して自身のコピーを作る（自己複製する）と考えられた。
上記の結果から、同一因子が発現動態を変えることによって神経幹細胞の増殖を活性化したり、特定の種類の細胞に分化誘導することが示唆された。たとえば、Ａｓｃｌ１は発現振動すると神経幹細胞の増殖を活性化し、蓄積するとニューロン分化を誘導すると考えられた。そこで、光応答性の転写因子であるＧＡＶＰＯのコドンをヒト化したｈＧＡＶＰＯを用いて、光照射依存的にＡｓｃｌ１の発現動態を人工的にコントロールできる実験系を開発した（図４）。３時間ごとに青色光を照射することでＡｓｃｌ１のオシレーションを、３０分ごとに青色光を照射することでＡｓｃｌ１の蓄積を神経幹細胞に誘導できた。
神経幹細胞に青色光照射を行い、Ａｓｃｌ１の３時間周期の発現振動を誘導したところ、細胞増殖（自己複製）が促進された。一方、Ａｓｃｌ１の蓄積を誘導したところ、ニューロン分化が誘導された。すなわち、従来用いられてきた外来性のたんぱく質や化合物を投与することなく、青色光の照射パターンを変えるだけで、神経幹細胞の増殖やニューロン分化を自在にコントロール可能な技術開発に成功した。この技術は、今後再生医療研究に貢献することが期待される。また、光照射による神経幹細胞の増殖・分化を制御する実験技術は、マウス脳内の神経幹細胞にも適応できる可能性があり、今後の実用化に向けて開発を推進したいと考えている。
本研究は、自己複製能と多分化能の両立という神経幹細胞を幹細胞たらしめている根幹のメカニズムを明らかにした。Ｈｅｓ１たんぱく質は、神経幹細胞だけではなく、万能細胞（ＥＳ細胞・ｉＰＳ細胞）や造血幹細胞・皮膚幹細胞などほとんどの幹細胞で発現が確認されていることから、本研究で見いだされた細胞分化決定因子の発現振動による制御機構は、他の種類の幹細胞においても普遍的に使用されているメカニズムであると考えられ、幹細胞研究全体への幅広い波及効果が予想される。
神経幹細胞の自己複製とニューロン分化誘導を「光」で制御できる技術は、脳損傷や神経変性疾患に対する再生医療研究に貢献することが期待される。また、光照射による神経幹細胞の増殖・分化コントロール技術は、脳内の神経幹細胞にも適応できる可能性がある。
神経幹細胞は、自己複製を行うことができ、かつ多分化能を持つ。
自己複製する神経幹細胞において、Ｈｅｓ１、Ａｓｃｌ１、及びＯｌｉｇ２の発現は発現振動する。
神経幹細胞から分化運命決定が行われる際には、発現振動を繰り返していたＨｅｓ１、Ａｓｃｌ１、Ｏｌｉｇ２たんぱく質のどれか１種類の発現レベルが上昇し、他の２種類のたんぱく質の発現が消失する。
光応答性の転写因子ｈＧＡＶＰＯを用いたＡｓｃｌ１の人工的発現誘導系。ｈＧＡＶＰＯは青色光の照射により２量体を形成し、ＵＡＳの下流に配置したＡｓｃｌ１の発現を誘導する。
光遺伝学的発現操作技術を用いて、Ａｓｃｌ１を３時間周期で発現振動（オシレーション）させたところ、細胞増殖が促進された。一方、Ａｓｃｌ１を蓄積発現させたところ、ニューロン分化が誘導された。
“Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors”
（神経幹細胞において多分化能と運命を決定する因子の発現振動による制御）
doi: 10.1126/science.1242366
京都大学 ウイルス研究所・ｉＣｅＭＳ
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