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平成25年2月22日

京都大学 iPS細胞研究所(CiRA)
長崎大学
科学技術振興機構(JST)

患者さん由来iPS細胞でアルツハイマー病の病態を解明
iPS細胞技術を用いた先制医療開発へ道筋

<ポイント>

1.要旨

近藤 孝之 大学院生(京都大学 大学院医学研究科 脳病態生理学講座臨床神経学(高橋 良輔 教授)/CiRA リサーチアシスタント/JST CREST)、井上 治久 准教授(京都大学 CiRA/JST CREST/JST 山中iPS細胞特別プロジェクト)、岩田 修永 教授(長崎大学 薬学部/JST CREST)の研究グループは、山中 伸弥 教授(京都大学 CiRA/JST 山中iPS細胞特別プロジェクト)らの研究グループと協力し、複数のアルツハイマー病(AD)の患者さんごとに存在する病態を明らかにして、iPS細胞を用いた先制医療への道筋を示しました。

筆者らは、若年性(家族性)ADの原因遺伝子であるアミロイド前駆体タンパク質(APP)に遺伝子変異を持つ患者さんと、家族歴のない高齢発症(孤発性)ADの患者さんの皮膚からiPS細胞を作製し、大脳の神経系細胞に分化誘導させました。解析の結果、APP−E693Δと呼ばれる変異があると、アミロイドベータ(Aβ)というタンパク質がオリゴマーと呼ばれる凝集体となって細胞内に蓄積し、小胞体ストレス注8)酸化ストレス注9)を引き起こし、細胞死を生じ易くすることが分かりました。また、ドコサヘキサエン酸(DHA)によって、これらの細胞内ストレスは軽減され、神経細胞死も抑制されました。さらに高齢発症の孤発性AD患者さんの中にもAPP−E693Δ変異と同様の細胞内Aβオリゴマーおよび細胞ストレスが見られるケースがあることが分かりました。

これらの研究結果は、iPS細胞技術応用は、疾患の病態解析や創薬研究に留まらず、孤発性を含めた患者さんごとの病態を事前に把握し適切な治療介入を行う「先制医療」にも用いることができることを示しています。この研究成果は2013年2月21日(米国東部時間)に米国科学誌「Cell Stem Cell」のオンライン版で公開されます。

2.研究の背景

アルツハイマー病(AD)は、老年期認知症の中で最も多い疾患であり、その病理特徴としては、脳内に老人斑といわれるタンパク質の蓄積が見られます。この老人斑の主成分がAβであり、Aβの過剰な蓄積がアルツハイマー病の発症に深く関わっていると考えられていましたが、病態への関与の仕方は、ヒトの脳の細胞では良く分かっていませんでした。

3.研究結果

1)アルツハイマー病患者さんからiPS細胞を作製し病態を再現

健常人(コントロール)3名と、APP−E693Δ変異もしくはAPP−V717L変異を持つ若年発症の家族性AD患者2名、さらに家族歴のない高齢発症の孤発性ADの方2名からiPS細胞を作製しました(図1)。

そしてヒトiPS細胞から神経系細胞(大脳皮質神経細胞やアストロサイト注10))に分化誘導する技術を開発し、患者さんの神経系細胞群をin vitro(生体外)で作製しました。するとAPP−E693Δ変異を持つiPS細胞由来の神経系細胞で、細胞内にAβオリゴマーが蓄積し、小胞体ストレスを引き起こしていることが分かりました(図2)。さらに、マイクロアレイチップを用いた網羅的な遺伝子発現解析により、酸化ストレスに応答する遺伝子群の発現が増加していることが明らかになりました。また、活性酸素(reactive oxygen species:ROS)注11)が増加していたことから、細胞内Aβオリゴマーを持つADの神経系細胞内部では細胞内酸化ストレスが引き起こされていますが、それに対して細胞が対抗措置を取り、細胞内環境を正常化しようとしていることが考えられました。

これらの細胞内ストレスはAβの合成阻害剤であるβセクレターゼ阻害薬(β−secretase inhibitor:BSI)によりAβを取り除くと改善されました。

2) Aβによる細胞内のストレスは、適切な濃度のDHAで改善する

APP−E693Δ変異を持つiPS細胞由来の神経系細胞に対して、3種の化合物(活性酸素の生成阻害剤や小胞体ストレスを軽減する試薬など)を添加し、小胞体ストレスに対する治療効果を調べました。すると、低濃度のDHAを添加した時のみ、小胞体ストレスに応答するタンパク質(BiP、Caspase−4)や酸化ストレス(peroxiredoxin−4、活性酸素種)を減らしましたが、残り2種の化合物や高濃度のDHAでは逆に小胞体ストレスを増強してしまいました。さらに、低濃度のDHAを添加することで、APP−E693Δ変異を持つiPS細胞由来神経細胞の自然細胞死を、改善させることができました。この結果は、適切な有効濃度が存在することを示しています(図3)。

3) 一部の孤発性ADにおいても細胞内Aβオリゴマーと細胞ストレスが観察された

若年発症型の家族性ADのみでなく、家族歴のない高齢発症の孤発性ADの患者さんにおいても解析を進めると、一名の方においてはAPP−E693Δ変異と同様に細胞内Aβ蓄積や細胞ストレスが見られ、低濃度DHAで細胞ストレスを除去することができました。

この結果は、DHAによる処置が有効であるアルツハイマー病の集団と有効でない集団が存在する可能性を示しています。つまり、一見同じに見えるADも、背景にひそむ病態は多様であり、病態特性に応じた治療戦略が必要であるということです。そして、iPS細胞技術による疾患を先制的に治療制御する医療への道筋を提示しています。

4.まとめ

本研究では、若年発症型および高齢発症の孤発性アルツハイマー病患者さんの神経細胞・アストロサイト内にAβオリゴマーが蓄積し、種々の細胞ストレスを引き起こしているケースがあることを明らかにしました。

より表現型の強い若年発症型アルツハイマー病患者さんのiPS細胞を用いて、病態解析や創薬研究のプラットフォームを開発し、孤発性アルツハイマー病患者さんのiPS細胞をそのプラットフォーム上で解析することで、患者さんの大部分を占める孤発性アルツハイマー病治療開発を推進する新たな方向性を示しました。

これらの成果を推し進めることで、従来の均一な疾患概念に対する画一的な治療を超えて、先制的な病態診断に基づき適切な治療を行う「先制医療」の開発が今後の課題であり、そのためには、iPS細胞技術のさらなる進展が必要であると考えられます。

<参考図>

図1

図1 本研究で作製したiPS細胞の位相差顕微鏡写真

図2

図2 神経細胞内に蓄積したAβの様子

緑色(または黄色)が蓄積したAβオリゴマー、青が細胞の核、赤が神経細胞を示す。コントロールの神経細胞ではAβオリゴマーは検出されない。

図3

図3 iPS細胞から分化誘導した神経細胞の生存解析とDHAによる治療効果

健常人(青色線)ではiPS細胞から分化誘導した神経細胞の自然細胞死は見られなかったが、APP−E693Δ変異を持つ家族性AD(黄色線)では、二週間程度の培養で細胞死が見られた。適切な量のDHAを添加して培養すると、細胞死が改善された。

<用語解説>

注1) アルツハイマー病(AD)
ドイツの精神科医、アルツハイマー博士により1905年に報告された進行性の記憶障害を伴う認知症。中高年で発病し、徐々に進行して生活に支障をきたすようになり、最終的には意思疎通ができなくなる。その病理特徴としては、脳内に老人斑といわれるタンパク質の沈着が見られ、この老人斑の主成分がAβであることから、Aβの過剰な蓄積がアルツハイマー病の発症に深く関わっていると考えられてきた。
注2) iPS細胞
人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cell)のこと。体細胞に特定因子を導入することにより樹立される、ES細胞に類似した多能性幹細胞。2006年に山中教授らの研究により世界で初めてマウス体細胞を用いて樹立に成功したと報告された。
注3) アミロイドベータ(Aβ)
40〜43個のアミノ酸が連なってできたペプチド(タンパク質断片)で、アミロイド β 前駆体タンパク質(APP)が、酵素であるγセクレターゼやβセクレターゼによって分解されることで生じる。ADでは、Aβが凝集して線維状になり、脳に沈着することが昔から良く知られている。
注4) Aβオリゴマー
Aβが数個〜十数個集まった凝集物のことで、アミロイドを作る線維状Aβとは区別されている。AD患者さんの中には、脳の老人斑(線維状のAβ)がみられない方もおられるので、現在、AβオリゴマーとADとの関係が詳しく調べられている。
注5) BSI(β−secretase inhibitor)
Aβ産生に関与するβセクレターゼの阻害薬。βセクレターゼに結合し、前駆体タンパク質からAβが生成するのを阻害する化学物質のこと。
注6) ドコサヘキサエン酸(DHA)
不飽和脂肪酸の一種で、主に細胞膜に存在する。魚油に多く含まれており、体内ではαリノレン酸から合成される。但し、α−リノレン酸は体内で合成することができない。
注7) 先制医療
病気の原因や進行に関する研究知見を基に、体内の異常を早期に診断し、病気を発症する前から治療を開始することで、病気の発症を遅らせる、もしくは防ぐことを目指す医療のこと。
注8) 小胞体ストレス
細胞内で生産されたタンパク質が正しい立体構造へと折りたたまれず、細胞小器官である小胞体に蓄積してしまうことで引き起こされるストレス反応のこと。小胞体ストレスが起きると、細胞内のタンパク質生産量が減り、小胞体でのタンパク質の折りたたみ負荷が減ったり、折りたたみを助けるタンパク質が増えたり、折りたたみがうまくいかなかったタンパク質の分解効率が増える。あまりにも大きな小胞体ストレスがかかった場合には、細胞死が起きる。
注9) 酸化ストレス
通常、生体内では活性酸素が生成したとしても、それらの除去(抗酸化作用)がすみやかに行われるが、このバランスが崩れ、活性酸素の生成が増えた時に、DNAやタンパク質、脂質などが攻撃を受けて、最終的にはさまざまな細胞小器官や細胞自身が傷つくこととなる状態のこと。
注10) アストロサイト
中枢神経系に存在する脳内最大の細胞集団で、神経細胞を取り囲み、神経活動を修飾したり、血流を調節したりすることで、神経ネットワークを支える働きがある。
注11) 活性酸素種(reactive oxygen species:ROS)
細胞が酸素を使った呼吸をする際に生じる反応性の高い酸素のこと。多くの場合は、抗酸化物質や抗酸化酵素によって除去されるが、過剰に生じると、多くの物質と反応しやすい性質のため、酸化ストレスを引き起こす。細胞内での情報伝達、代謝調節などに加え、感染が起こった時に白血球が活性酸素で細菌を攻撃するなどの生理機能を持つ。
注12) JST 戦略的創造研究推進事業 チーム型研究(CREST)
研究領域 「人工多能性幹細胞(iPS細胞)作製・制御等の医療基盤技術」
 (研究総括:須田 年生 慶應義塾大学 医学部 教授)
研究課題名 「iPS細胞を駆使した神経変性疾患病因機構の解明と個別化予防医療開発」
研究代表者 井上 治久(京都大学 iPS細胞研究所 准教授)
研究期間 平成21年10月〜27年3月
JSTはこの領域で、iPS細胞を基軸とした細胞リプログラミング技術の開発に基づき、その技術の高度化・簡便化をはじめとした研究によって、革新的医療に資する基盤技術の構築を目指している。上記研究課題では、基礎および臨床の研究者を結集して、患者由来iPS細胞を用いて神経変性疾患の病因メカニズムの解明および個別化予防医療開発を目的としている。

6.論文名、著者およびその所属

○論文名

“Modeling Alzheimer's disease using iPSCs reveals stress phenotypes associated with intracellular Aβ and differential drug responsiveness”
doi: 10.1016/j.stem.2013.01.009

○ジャーナル名

Cell Stem Cell

○著者

Takayuki Kondo,1,2,7 Masashi Asai,7,9,10 Kayoko Tsukita,1,7 Yumiko Kutoku,11 Yutaka Ohsawa,11 Yoshihide Sunada,11 Keiko Imamura,1 Naohiro Egawa,1 Naoki Yahata,1 Keisuke Okita,1 Kazutoshi Takahashi,1 Isao Asaka,1 Takashi Aoi,1 Akira Watanabe,1 Kaori Watanabe,7,10 Chie Kadoya,7,10 Rie Nakano,7,10 Dai Watanabe,3 Kei Maruyama,9 Osamu Hori,12 Satoshi Hibino,13 Tominari Choshi,13 Tatsutoshi Nakahata,1 Hiroyuki Hioki,4 Takeshi Kaneko,4 Motoko Naitoh,5 Katsuhiro Yoshikawa,5 Satoko Yamawaki,5 Shigehiko Suzuki,5 Ryuji Hata,14 Shu-ichi Ueno,15 Tsuneyoshi Seki,16 Kazuhiro Kobayashi,16 Tatsushi Toda,16 Kazuma Murakami,6 Kazuhiro Irie,6 William L. Klein,17 Hiroshi Mori,18 Takashi Asada,19 Ryosuke Takahashi,2 Nobuhisa Iwata,7,10,* Shinya Yamanaka,1,8 and Haruhisa Inoue1,7,8,*

*) 責任著者

○著者の所属機関

7.本研究への支援

本研究は、下記機関より資金的支援を受けて実施されました。

<研究に関するお問い合わせ先>

<本件担当>

京都大学 iPS細胞研究所(CiRA)
研究支援部門 国際広報室
遠山
TEL:075-366-7005
FAX: 075-366-7023
E-mail:

(英文)Modeling Alzheimer's disease using iPSCs reveals stress phenotypes associated with intracellular Aβ and differential drug responsiveness