ポイント
- 高分子ミセルは次世代ＤＤＳとして期待されているが、内部の詳細な構造は未知であった。
- 新しい手法の小角Ｘ線異常散乱法をＤＤＳ粒子に初めて適用して、内部の精密な構造を解明。
- 高性能なＤＤＳ開発の基本指針を与え、遺伝子治療や抗がん剤の応用に期待。
ＪＳＴ 課題達成型基礎研究の一環として、北九州市立大学の櫻井 和朗 教授らは、次世代の薬物運搬方法（ドラッグデリバリーシステム：ＤＤＳ）として期待されている数１００本のひも状高分子が凝集した高分子ミセル粒子注１）の内部構造を、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８注２）の安定したＸ線計測システムと、小角Ｘ線異常散乱注３）という技法を用いて精密に解析し、粒子内部に薬剤がどのように保持されているかを世界で初めて明らかにしました。
ＤＤＳは、薬剤をナノサイズのキャリア注４）（運び屋）に封入し、患部で選択的に薬剤を放出させる仕組みで、①副作用が大幅に低減できる、②水に溶けなかったり、生体中で容易に分解してしまうために従来は投与できない薬剤を投与できる、などの利点があります。薬剤の封入状態を知ることは性能向上のために重要ですが、ＤＤＳ粒子の大きさは数ナノメートル（ｎｍ：ナノは１０億分の１ｍ）であるため、これまで内部構造を見ることができませんでした。
今回、研究チームは、東京大学の雨宮 慶幸 教授のグループが開発したＸ線小角異常散乱という新しい技法を、東京慈恵会医科大学の横山 昌幸 准教授らが臨床応用を進めている高分子ミセルに適用しました。小角Ｘ線異常散乱の測定精度の向上にはＸ線強度の１％以下の差を厳密に決定する必要があるため、ＪＡＳＲＩの八木 直人 副部門長らは、ＳＰｒｉｎｇ－８で得られる極めて安定・高強度のＸ線を用い、特別な装置を考案してノイズを低減することで、世界最高精度の測定を可能としました。さらに、櫻井 和朗 教授らのナノ界面の解析技術を使うことで、高分子ミセル内部の構造と薬剤の保持状態を可視化することに初めて成功しました。その結果、ミセル内部に閉じ込められていると思われていた薬剤が内核と外殻の界面にも薄い層を形成して、外にはみ出していることが分かりました。このような知見は薬剤の放出挙動のメカニズムと深く関係していると考えられます。つまり、高分子ミセルが薬剤を取り込む時にこのような層を形成しているならば、ミセルと細胞の接触時に層と細胞との間で薬剤のやり取りが可能であると考えられます。
本研究成果により、より高性能なＤＤＳを開発するための基礎的な知見が得られ、遺伝子治療や抗がん剤の副作用の低減や高効率化につながると期待できます。本研究成果は、米国化学会誌「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」のオンライン版で近日中に公開されます。
本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。
戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）
| 研究領域 |
「ナノ界面技術の基盤構築」
（研究総括：新海 征治 崇城大学 教授／九州大学 工学部 ナノサイエンス学科 名誉教授）
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| 研究課題名 |
「ＤＤＳ粒子のナノ界面と鳥インフルエンザワクチン等への応用」 |
| 研究代表者 |
櫻井 和朗（北九州市立大学 国際環境工学部 教授） |
| 研究期間 |
平成１９年１０月～平成２５年３月 |
ＪＳＴはこの領域で、異種材料･異種物質状態間の接合界面を扱う研究分野の融合によってナノ界面機能に関する横断的な知識を獲得するとともに、これを基盤として界面ナノ構造を自在に制御し、飛躍的な高機能化を可能にする革新的なナノ界面技術を創出することを目的としています。上記研究課題では、次世代のＤＤＳナノ粒子に関して、粒子の内部構造、粒子内の疎水／親水界面における薬物の挙動と形態、生体膜との融合挙動を、放射光を用いて精密に解明し、この結果を利用して、遺伝子デリバリーやたんぱく質製剤の分野に新しいＤＤＳ技術を提供することを目標としています。
＜研究の背景と経緯＞
製薬メーカーでは、効果的な薬効を目指してさまざまな新規化合物の探索がなされています。しかし、副作用の強さから、たとえ非常に高い効用が見込まれていても実用化に結びつかない例が数多く存在します。普通、薬剤は、体内に投与すると血流に乗り全身へと拡散します。このため、患部へ届く薬剤の量は投与量の１，０００～１０，０００分の１程度に激減します。また、患部以外の部分に届けられた薬剤が正常な組織を破壊し、重大な副作用を引き起こすことがあります。特に、細胞の増殖機能を強力に抑える抗がん剤ではこの副作用の問題が深刻です。これらに対する解決策の１つとして、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）があります。ＤＤＳとは、薬剤をナノサイズのキャリアに封入し、患部で選択的に薬剤を放出させる仕組みです。特に、がん細胞はナノサイズの粒子を取り込む性質があるため、この効果を利用して、ナノサイズの粒子に抗がん剤を閉じ込めたＤＤＳ粒子を使ってがんに選択的に薬剤を送達する仕組みが提案されています。
日本はＤＤＳナノ粒子の研究では世界の先端を走っています。その中で、ＣＲＥＳＴのメンバーである横山准教授らが研究している高分子ミセルは、人への臨床試験のフェーズⅢ（臨床試験の最終段階）が進められています。高分子ミセルにおいて薬剤を取り込んだり（図１）、放出したりするメカニズムは、直接ＤＤＳの働きに結びついており、このメカニズムの解明はＤＤＳキャリアの開発、改良において非常に強力な手がかりとなります。しかし、高分子ミセルはナノサイズであるため、これまで電子顕微鏡などを用いた直接観察は不可能でした。
ＳＰｒｉｎｇ－８の高強度で安定したＸ線と新しい測定法である小角Ｘ線異常散乱
Ｘ線は物質透過性の光であるため、対象を非破壊で、その内部の情報まで明らかにできます。実際にＤＤＳキャリアの構造の決定にＸ線は広く利用されています。日本には世界に誇る第３世代放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８があり、生命現象の根幹であるたんぱく質の構造解析などで、薬剤開発に大きな貢献をしてきました。今回、ここで得られる高強度のＸ線を利用することでキャリアの詳細を鮮明にすることを目指しました。ＳＰｒｉｎｇ－８をはじめとする、第３世代の放射光施設では、安定で極めて強力なＸ線源を用いた先進的な構造解析に関する技術開発が進んでいます。本研究で用いた小角Ｘ線異常散乱（ＡＳＡＸＳ）もその１つです。ＣＲＥＳＴの雨宮教授と篠原助教のグループではこのＡＳＡＸＳをたんぱく質やコロイド、ミセルなどのソフトマテリアルに適用できるような研究開発を長年行ってきました。ソフトマテリアルにおけるＡＳＡＸＳの応用は、世界でも始まったばかりであり、日本ではほとんど行われていない状況です。安定性の高いＸ線ビームを得るために、ＣＲＥＳＴのメンバーである八木副部門長のグループはＸ線分光器とＸ線検出器の安定化を行いました。特に本研究で使用したイメージングプレートＸ線検出器は、読み出し時の不安定性が従来から指摘されており、読み出し用レーザーの安定性を向上するなどして、常に良質のデータが記録できるよう改良を行いました。
従来の小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）測定技術では、測定試料中の全ての情報を反映してしまうために複雑な系中の微細な違いを明らかにすることは困難です。これに対しＡＳＡＸＳは、特定の原子のＸ線吸収を利用することで、ＳＡＸＳから得られる全情報から特定の原子に関する情報のみを取り出し、その原子のみの集合の形状、分布の詳細を明らかにすることが可能です。また、Ｘ線は物質透過性の光であるため、対象を非破壊でその内部の情報まで明らかにすることが可能です。ＡＳＡＸＳを利用し、薬剤に標識となる原子を修飾することで、キャリアの情報とは分離して薬剤の様子のみを知ることができます。
＜研究の内容＞
今回、ＡＳＡＸＳで測定した試料について説明します。高分子ミセルのキャリアは臨床試験が進められているものと成分の構造が極めて近いものです（図２）。成分は親水性であるポリエチレングリコールと疎水性に加工されたペプチドからなるひも状のポリマーであり、これが、疎水部をコア（内核）、親水部をシェル（外殻）として、水中で凝集して半径１５ｎｍ程度のミセル構造を形成します。一方、薬剤のモデルとして使用した化合物を図３に示しました。ＡＳＡＸＳ測定には、試料中にＸ線を吸収する原子の存在が必要となりますので、Ｘ線を吸収する原子を持たない薬剤の代わりに臭素修飾したモデル化合物を用いました。これ自体には薬理効果はありませんが、物理的性質が他の抗がん剤と近いためモデルとして使用したものです。臭素を多く付加させた理由は、臭素がＡＳＡＸＳのプローブとして扱いやすいためです。
ＡＳＡＸＳ測定には極めて高いＸ線の純度が求められますが、ＳＰｒｉｎｇ－８で得られる世界最高の安定かつ強力なＸ線源を用いることで高精度の実験結果を得ることができました。ＡＳＡＸＳの測定をミセル系に適用するために、図４に示す特殊な真空セルを櫻井グループで設計しました。従来は試料を空気中において測定していましたが、ノイズを低減するために、溶液を耐圧容器に封入し、真空チャンバー内に入れて測定することにしました。
これまで、疎水性の化合物は同じく疎水性のコアに取り込まれると考えられてきました。今回、ＡＳＡＸＳを用いてモデル化合物の分布状態を調べた結果、化合物はコアのみではなく、その外側のコアとシェルの界面にはみ出して分布していることが明らかになりました（図５）。はみ出している量は全体の５％程度であり、これらはコアとシェルの界面に作られたポリエチレングリコールの密集層の根元に１ｎｍ程度の層を作ってはみ出していることが分かりました。
このはみ出した部分は直接周囲の水とも接しており、ＤＤＳにおける薬剤の放出挙動にも大きく関わるものと考えられます。通常コア中に取り込まれた薬剤と標的細胞が直接接することは不可能です。しかし、水と接しているこのはみ出した部分であれば標的細胞との直接の接触、ひいては高効率な送達が可能であると考えられます（図６）。このスケールでの観察は、他の電子顕微鏡などでは分解能の面から不可能でした。また、透過性のＸ線を用いることで、ＤＤＳキャリアが実際に作用する水中でのそのままの形態を非破壊で観察することに成功したことにもなります。
＜今後の展開＞
これまでＤＤＳにおける薬剤の放出の詳細なメカニズムは未解明のまま、その結果の大小だけが重要視されてきました。今回の系では、これまで考えられてきた高分子ミセルが細胞内でほどけて薬剤が放り出されるものでなく、ナノ界面にある薬剤がナノ界面と細胞との接触時に直接受け渡しをするというメカニズムが示唆されました。このような薬物の放出の具体的なメカニズムが分かると、効果的なＤＤＳの効率の良い設計が可能となります。また、薬物放出の精密な人為的制御が可能になれば、病状や個人に合わせた医薬を提供するテーラーメイド医薬の実現が期待できます。例えばがんの場合は、今まで副作用が強くて使用できなかった抗がん剤をがん細胞だけに送り、そこで精密に制御された放出が行えれば、副作用を抑えながらがん細胞だけを死滅させる治療につながります。
また、ナノオーダーの生体材料の構造がＸ線により精密に測定、可視化できたことは、未解明な部分の多い生体材料の微細構造解析に大きく貢献するものと期待されます。
＜参考図＞
図１ 高分子ミセルの概略
親水性と疎水性からなるブロック共重合体の自己会合により形成され、内核－外殻構造を持つナノ粒子。疎水性の内核（コア）には疎水性の分子を取り込むことができ、水に溶けにくい薬剤を取り込むＤＤＳキャリアとしての応用が期待されている。また、親水性の外殻（シェル）は体内の免疫作用による排除を受けにくいステルス効果を発揮し得る。
図２
モデルとした高分子ミセルの成分（アスパラギン酸のベンジルエステルとポリエチレングリコールのブロック共重合体）。臨床が進んでいるキャリアに用いられているものと極めて近い。
図３
薬剤のモデル（プローブ分子）として使用したＴＢＣ（tetrabromocatechol）。
図４ 今回用いたＡＳＡＸＳ装置の、従来のものとの比較
従来は試料を空気中において測定していたが、今回は、溶液を耐圧容器（上）に封入して、真空チャンバー内に入れて測定した。これにより、従来の空気中で測定する際に必要であった窓材を省くことができ、ノイズを大幅に低減することができた。
図５ 小角Ｘ線異常散乱の概略と結果
粒子に入射したＸ線はさまざまな角度に散乱する。この散乱Ｘ線の角度と角度に対応する強度の関係から粒子の構造が明らかになる。また特定のＸ線波長を吸収する標識原子が存在すると散乱Ｘ線の強度が変化し、この変化が標識原子の状態を反映している。ミセル全体からの散乱情報と標識原子のみの散乱情報から右下図のような構造が明らかになった。疎水性コアの外側、親水性シェルの界面部に、はみ出した化合物の標識原子が見える。
図６ 今回の測定結果から予想されるＤＤＳのメカニズム
これまで疎水性の薬剤は高分子ミセルの内核に封入されていると考えられてきた。通常外殻部と細胞の接触は可能だが、内核と細胞が接触することは考えにくく、内核中の薬剤がどのように細胞に送達されるのか未解明であった。今回明らかとなった薬剤が外殻のナノ界面にはみ出して存在する構造では、ナノ界面と細胞が接触した際に薬剤が容易に細胞に取り込まれると考えられる。
＜用語解説＞
- 注１） 高分子ミセル粒子
- 親水性と疎水性からなる、ブロック共重合体の自己会合により形成され、内核－外殻構造を持つナノ粒子。抗がん剤であるアドリアマイシン封入高分子ミセルの開発例などがあるが、錠剤、顆粒剤、微粒子製剤の膨大な薬剤学的知識・ノウハウと比較にならない程、高分子ミセル製剤についてはその蓄積が少ない。その意味で、今後、本研究のような、製剤学的な研究が加えられることで、高分子ミセルの実用化が大幅に進むと考えられる。
- 注２） 大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８
- ＳＰｒｉｎｇ－８は、世界最高性能の放射光（赤外線や紫外線、Ｘ線などを含んだ光）を利用することができる大型の実験施設であり、国内外の研究者に広く開かれた共同利用施設として、物質科学・地球科学・生命科学・環境科学・産業利用などの分野で優れた研究成果をあげている。
- 注３） 小角Ｘ線異常散乱（ＡＳＡＸＳ：Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｓｍａｌｌ ａｎｇｌｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）
- ナノ構造の情報を得ることのできる小角Ｘ線散乱法（ＳＡＸＳ）は、ナノテクノロジーの強力な分析方法の１つとして広く使われている。小角Ｘ線散乱法では入射するＸ線の波長は一定であるが、小角Ｘ線異常散乱では異なる波長のＸ線を用いることで、特定の元素についての情報を得る。
- 注４） キャリア
- ＤＤＳにおいて薬剤を取り込み、体内で標的部位に送達するために用いられる素材である。送達する薬剤、対象となる標的部位、求める薬効時間によってさまざまなキャリアが検討されており、その設計次第で任意の性能を持たせることができ、幅広い応用が可能である。高分子ミセルはキャリアの素材の一種である。
＜論文タイトル＞
“Hydrophobic Molecules Infiltrating into the PEG Domain of the Core/Shell Interface of a Polymeric Micelle: Evidence Obtained with Anomalous Small-Angle X-ray Scattering”
（小角Ｘ線異常散乱から得られた高分子ミセルのコア／シェル界面のポリエチレングリコール部位への疎水性分子のはみ出しの証拠）
doi: 10.1021/ja308965j
＜お問い合わせ先＞
＜研究に関すること＞
櫻井 和朗（サクライ カズオ）
北九州市立大学 国際環境工学部 教授
〒808-0135 福岡県北九州市若松区ひびきの１－１
Tel：093-695-3298 Fax：093-695-3390
E-mail：
研究室ホームページ：http://www.sakurai-lab.jp/
横山 昌幸（ヨコヤマ マサユキ）
東京慈恵会医科大学 准教授
〒105-8461 東京都港区西新橋３－２５－８
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