JSTトッププレス一覧 > 共同発表

平成25年1月23日

京都大学 iPS細胞研究所(CiRA)
科学技術振興機構(JST)

ヒトiPS細胞を用いて腎臓の一部構造を再現

ポイント

1.要旨

前 伸一 研究員(京都大学 CiRA)、長船 健二 准教授(京都大学 CiRA、JST さきがけ注2)、JST 山中iPS細胞特別プロジェクト)らの研究グループは、ヒトiPS細胞を分化誘導させ、腎臓や生殖腺などの元となる中間中胚葉へと高効率に分化させることに成功しました。腎臓再生に向けた大きな一歩を踏み出したといえます。

腎臓の細胞のほとんどは中間中胚葉から分化するため、腎臓再生に向けて、まずヒトiPS/ES細胞から中間中胚葉へと高効率に分化させる技術の開発が必要です。研究グループはヒトのiPS/ES細胞で効率良く遺伝子の相同組み換え注3)を起こさせる技術を確立し、ヒトiPS細胞で中間中胚葉の分化マーカー遺伝子(Odd−skipped related1:OSR1)に緑色蛍光タンパク質(GFP)注4)を導入することに成功しました。この細胞を用いて、iPS細胞から90%以上の高効率で中間中胚葉へと分化させる方法を確立し、さらに得られたヒト中間中胚葉が実際に腎臓の様々な細胞に分化することも明らかにしました。この研究成果は、iPS細胞から腎臓の再生医療に使用する細胞を供給できる可能性を示しています。また、この分化システムが、中間中胚葉の発生メカニズムを解明する新たな研究ツールを提供することも期待されます。

この研究成果は2013年1月22日(英国時間)に「Nature Communications」にオンライン公開されます。

2.研究の背景

腎臓は構造や発生機構が複雑であると同時に、老廃物の排泄や血圧の調節、赤血球の合成促進など生理学的に重要な様々な役割を果たしています。腎臓はいったん傷つくとその機能を修復することはほとんどできず、機能不全が進行すると人工透析により命をつなぐことになります。日本の透析患者数は30万人を超え注5)透析医療費は全医療費のおよそ6%を占めており注6)、腎臓を再生する研究が期待されています。

iPS細胞やES細胞を使って腎臓の細胞を誘導する試みが行われていますが、ヒトのiPS/ES細胞を用いて腎臓の細胞を誘導する技術は完成していません。これまでの発生生物学的研究から腎臓は中間中胚葉から発生することがわかっています。iPS/ES細胞から中間中胚葉を高効率に誘導することは、腎臓の細胞を誘導する上で最初の重要なステップとなります。

3.研究結果

1)ヒトiPS/ES細胞のゲノムへ効率良く相同組み換えによる遺伝子導入を行う技術を確立

目的の細胞で特異的に発現する遺伝子に蛍光タンパク質を導入することにより、目的の細胞に分化した細胞のみを見分けることができます。しかし、これまでヒトiPS/ES細胞に相同組み換えによる遺伝子導入をする技術は難しく、容易にできるものではありませんでした。研究グループはBAC(bacterial artificial chromosome)ベクターとSNP(single nucleotide polymorphism)アレイ解析を用いて、ヒトiPS/ES細胞のゲノムに効率良く相同組み換えを行う技術を確立しました。この技術を用いて、中間中胚葉の分化マーカー遺伝子であるOSR1にGFPを導入し、中間中胚葉に分化した細胞のみGFPが発する光により検出できる評価系を構築しました。

2)ヒトiPS細胞から中間中胚葉を高効率に分化させる方法を確立

1)で確立した細胞の評価系を利用し、ヒトiPS/ES細胞から中間中胚葉へと分化させる最適な方法を検討しました。様々な成長因子のうち、BMP7(bone morphogenetic protein 7)、activin AおよびWnt3aを細胞に作用させることにより、中間中胚葉へと高効率に分化誘導できることを明らかにしました。更に低分子化合物(CHIR99021)を用いて分化させる効率を高め、分化誘導後11日目には90%以上の細胞がOSR1を発現し、中間中胚葉に分化していることを確認しました(図1)。

3)ヒトiPS細胞から誘導した細胞で、腎尿細管の構造を再現

2)で樹立した中間中胚葉をマウス胎児の腎臓細胞と共培養したところ、一部の細胞で管状の構造を形成したものがあり、その細胞は腎尿細管のマーカーであるLTL(Lotus Tetragonolobus lectin)が陽性であり、かつ、尿細管上皮細胞の指標であるLAMININを発現していることを確認しました。従って今回確立した方法でヒトiPS/ES細胞から誘導した中間中胚葉には、腎臓の3次元構造を作る能力があることが示されました(図2)。

4.まとめ

本研究では、容易にヒトiPS/ES細胞のゲノムに蛍光タンパク質を相同組み換え法にて遺伝子導入する方法を確立しました。この技術により、目的の細胞になっているか否かを評価できるシステムを構築し、効率の良い分化誘導方法を開発しました。最終的に3種の成長因子と化合物の組み合わせで高効率にヒトiPS細胞から腎臓の元となる中間中胚葉を誘導できることを明らかにしました。また、これらの細胞から腎尿細管の構造を作製することにも成功しました。

次のステップとしてヒトiPS/ES細胞由来の中間中胚葉細胞を腎臓の細胞へと効率良く、かつ特異的に分化させる方法を開発する必要があります。さらに、中間中胚葉は腎臓・副腎・生殖腺の3種に分化することが知られており、腎臓のみならず、副腎や生殖腺の再生医療にも応用が期待されます(図3)。

<参考図>

図1

図1 ヒトiPS/ES細胞から中間中胚葉へと分化した細胞の割合の推移

分化誘導後、中間中胚葉の指標であるOSR1を発現している細胞の割合が増加し(図内で赤点の集団が右側へとシフト)、11日目には90%を超える細胞が中間中胚葉へと分化したと読みとれる。

図2

図2 中間中胚葉から誘導した一部の細胞で腎尿細管の構造を形成

管構造を形成した細胞はLAMININおよびLTLが共に陽性であり、腎尿細管であると考えられる。

  • 緑:ヒトミトコンドリア(ヒト中間中胚葉由来の細胞であることを意味する)
  • 青:核
  • 紫:LAMININ
  • 赤:LTL
  • 図中のバーは50μmを示す。
図3

図3 ヒトiPS細胞から腎臓細胞へと分化させるステップ

今回効率良く誘導する方法を確立した中間中胚葉は、腎臓だけではなく、副腎や生殖腺の細胞にも分化する能力を持っている。

5.用語説明

注1) 中間中胚葉
脊椎動物の個体発生の過程で現れる細胞集団のこと。将来になる細胞の種類に応じて大きく外胚葉・内胚葉・中胚葉に分類され、さらに中胚葉は、大きく分けて中間中胚葉・沿軸中胚葉・側板中胚葉の3つに分類される。中間中胚葉は将来腎臓や副腎、生殖腺へと分化する細胞を含んでいる。
注2) JST 戦略的創造研究推進事業 個人型研究(さきがけ)
研究領域
「iPS細胞と生命機能」
(研究総括:西川 伸一 (独)理化学研究所 発生・再生科学総合研究センター 副センター長)
研究課題名 多発性嚢胞腎患者由来のiPS細胞を用いた病態解析
個人研究者 長船 健二
研究期間 平成20年6月〜平成24年3月
注3) 相同組み換え
DNAの塩基配列がよく似た領域(相同部位)で起こるDNAの組換えのこと。2本鎖のDNAには、切断や変異が起こっても相補鎖を元に修復する機能が備わっており、これらの性質を応用して目的の場所の遺伝情報を変える技術。これまでヒトのiPS/ES細胞では難しい技術であった。
注4) 緑色蛍光タンパク質(GFP)
オワンクラゲ由来の緑色の蛍光を発するタンパク質で、下村 脩 博士によって発見された。細胞内で目的タンパク質の発現を検出するのに使用される。本研究では、中間中胚葉の細胞のみがGFPの蛍光を持つように設計し、GFPを指標として中間中胚葉の細胞を選別した。
注5) 日本の透析患者数
日本透析医学会「図説 わが国の慢性透析療法の現況」によると2011年12月現在で慢性透析患者数は304,592人であり、30万人を超えた。 http://docs.jsdt.or.jp/overview/pdf2012/p03.pdf
注6) 透析医療費が全医療費に締める割合
第39回社会保障審議会医療保険部会委員提出資料では、2009年度の人工腎臓(透析)の医療費は推計1.2兆円に対して医療費総額は18.6兆円と報告され、およそ6%を占めている。
http://www.mhlw.go.jp/stf/shingi/2r9852000000qbvu-att/2r9852000000qs0f.pdf

6.論文名と著者

○論文名

“Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells”

doi: 10.1038/ncomms2378

○ジャーナル名

Nature Communications

○著者

Shin-Ichi Mae1*, Akemi Shono1*, Fumihiko Shiota1, Tetsuhiko Yasuno1, Masatoshi Kajiwara1,
Nanaka Gotoda-Nishimura1, Sayaka Arai1, Aiko Sato-Otubo5, Taro Toyoda1, Kazutoshi Takahashi1,
Naoki Nakayama6, Chad A. Cowan7, Takashi Aoi1, Seishi Ogawa5, Andrew P. McMahon7,
Shinya Yamanaka1, 2, 4, 8 and Kenji Osafune1, 3, 4**

*)これらの研究者はこの論文に同程度寄与しました。
**)責任著者

○著者の所属機関

7.本研究への支援

本研究は、下記機関より資金的支援を受けて実施されました。

<問い合わせ先>

京都大学 iPS細胞研究所(CiRA) 研究支援部門 国際広報室
和田M
Tel:075-366-7005 Fax:075-366-7023
E-mail:

(英文)Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells