脳梗塞を悪化させる新規メカニズムを発見

ポイント

• 脳梗塞では梗塞部位の炎症反応が症状を悪化させるが、その仕組みに謎が残っている
• 細胞保護酵素ペルオキシレドキシンの細胞外放出が炎症の引き金であると判明
• 細胞外ペルオキシレドキシン阻害で、マウスの症状改善－新たな治療標的として期待

＜研究の背景と経緯＞

脳梗塞とは、脳の血管が詰まるなどして脳血流が乏しくなること（虚血）によって脳組織が壊死に陥る病態です。日本では患者総数９６万人といわれ、がんに匹敵する患者数です（「平成２０年患者調査」厚生労働省）。脳梗塞の死亡者数は年間約７万人（「平成２２年人口動態統計」厚生労働省）で、死亡率が高いだけでなく、助かっても寝たきりになるなど患者の生活の質（ＱＯＬ）が非常に悪いことが特徴です。これまでの脳梗塞の治療は発症直後（４．５時間以内）に血栓溶解薬を投与するなど、限られた治療法しかありませんでした。しかし梗塞後徐々に炎症が起こって脳組織が浮腫を起こして腫れることにより、梗塞領域が広がったり、病状が悪化したりすることがあり、これらを抑制することも重要と考えられています（参考文献１－３）。脳組織に炎症が起こると、壊死した組織の中に血液由来の免疫細胞（マクロファージやリンパ球）が多数存在し、活性化した免疫細胞が炎症性因子を産生することによってさらに炎症が促進されます。その結果、壊死した組織周囲の正常組織を傷つけて梗塞領域を拡大させます。特に、マクロファージは発症早期に浸潤し炎症をスタートさせる重要な細胞です。しかし、マクロファージがどのような機構で活性化されるのかは全く不明でした。

これまで、マクロファージが細菌を認識するのに使っているＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）^注２）（この分子の発見者は２０１１年のノーベル賞を受賞）が脳梗塞後の炎症に必要だということは分かっていました。しかし脳は無菌的でクリーンな臓器であり、細菌やウイルスなどの外敵は通常存在しません。従って、ＴＬＲに認識される何らかの物質が脳組織の中にもともと存在しており、その物質は脳組織が壊死に陥った時に細胞外にばらまかれて、ＴＬＲを介してマクロファージを刺激して活性化させると考えられます。このような物質は、ダメージ関連分子パターン（ Ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ：ＤＡＭＰｓ）^注３）と呼ばれています。これまで脳内のＤＡＭＰｓは不明で、治療の標的になりうるかどうかも分かっていませんでした。

＜研究の内容＞

今回、本研究グループは、脳組織中に存在する新規のＤＡＭＰｓとしてペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ：Ｐｒｘ）を同定し、このＰｒｘが壊死した脳組織の中で放出されて、浸潤したマクロファージを活性化させ、炎症を引き起こしていることを発見しました。

まず、脳組織の抽出液を作製し、これを培養したマクロファージと同様な機能を持つ樹状細胞に添加したところ、さまざまな炎症性サイトカイン（ＩＬ－２３、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αなど）を産生することが分かりました。脳抽出液を、たんぱく質分解酵素で処理すると活性能力がなくなることから、脳抽出液中の樹状細胞を活性化する物質はたんぱく質であることが分かりました。そこで、脳抽出液をさまざまに分画し最終的に質量分析計を用いた解析によって、Ｐｒｘファミリーたんぱく質が樹状細胞を活性化していることを突き止めました（図２）。

Ｐｒｘファミリーたんぱく質は、細菌から哺乳類まで幅広く存在し、通常は細胞内にあって過酸化水素を水に変換する酸化防止酵素として知られていました。従って、虚血などのストレスの際には大量に合成されて、細胞内の過酸化水素を水に変換して細胞を保護する働きがあると考えられていました。しかし、細胞が壊死するとＰｒｘは細胞の外に放出されます。虚血に陥った脳組織では、壊死した組織の周りにＰｒｘを含む細胞の残骸が集積しており、さらにマクロファージと接触していることを発見しました（図３）。これらのことは、虚血ストレスの際に細胞を生存させるために細胞内でＰｒｘが発現されますが、細胞死に至るとＰｒｘは細胞外に放出され、周囲に浸潤したマクロファージを活性化するメカニズムがあると考えられました（図４）。

実際に、Ｐｒｘが樹状細胞を活性化するメカニズムを調べてみると、Ｐｒｘは樹状細胞の表面に存在するＴＬＲ２やＴＬＲ４を介してマクロファージを活性化していることが分かりました。Ｐｒｘの変異体を作製して、樹状細胞を活性化するのに必要な構造を調べたところ、Ｐｒｘファミリーたんぱく質に共通して存在するα３－ｈｅｌｉｘという構造がＴＬＲ２やＴＬＲ４を介してマクロファージを活性化させていることが判明しました（図５）。

次に、細胞外に放出されたＰｒｘの活性を除去するために中和抗体を作製しました。この抗体は、試験管内で脳抽出液の樹状細胞活性化能を半分以上抑制できることが分かりました。Ｐｒｘ抗体を一過性脳虚血モデル^注４）マウスに投与したところ、脳組織での炎症性サイトカインが抑えられ、梗塞体積が縮小し、神経症状が著しく改善しました（図６）。 いろいろな炎症でＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ　ｍｏｂｉｌｙ　ｇｒｏｕｐ　ｂｏｘ１）というたんぱく質がＤＡＭＰｓとして働くことが報告されています。脳梗塞モデルにおいてもＨＭＧＢ１の細胞外放出が認められましたが、ＨＭＧＢ１はマクロファージが脳組織に浸潤する頃には消失し、炎症を引き起こす原因には直接は関与していないことも分かりました。本研究グループの実験から、ＰｒｘはＨＭＧＢ１より遅れて虚血後１２時間をピークに細胞外に放出されることにより、脳組織に浸潤したマクロファージを活性化することが分かりました（図７）。

＜今後の展開＞

本研究によって脳梗塞における新たな炎症メカニズムが判明しました。さらに、脳梗塞患者の脳内においても同様に、Ｐｒｘが細胞外に放出されていることが報告されています（参考文献４）。そのためＰｒｘは、脳梗塞における治療開始可能時間の比較的長い治療のターゲットになり得ると考えられ、本研究の知見が脳卒中医療に応用されることが期待されます。

＜付記＞

本研究成果において、ＩＬ－２３の誘導因子が存在することを確かめるにあたり、ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）「アレルギー疾患・自己免疫疾患などの発症機構と治療技術」研究領域（研究総括：菅村 和夫　宮城県立病院機構　理事長）における研究課題「細胞内シグナル制御による免疫リプログラミング」（研究者：吉村 昭彦　慶應義塾大学 医学部 微生物学・免疫学教室　教授）の支援を受けました。

＜参考図＞

図１　脳虚血による炎症を引き起こすメカニズム（仮説）

脳虚血によって組織の細胞死が起こると、何らかのメカニズムによって、脳内に浸潤した血液細胞（マクロファージなど）が活性化され、炎症性因子を産生することによりさらなる組織傷害が引き起こされる。

図２　脳抽出液中に存在する、ＩＬ－２３誘導活性を持つたんぱく質の同定

• ①脳をすり潰した抽出液を樹状細胞に添加すると炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－２３が産生される。たんぱく質分解酵素で処理した脳抽出液ではＩＬ－２３は誘導されない。
• ②脳抽出液をショ糖濃度勾配によって分子量で分画すると、１５～２５ｋＤａの分画にＩＬ－２３誘導活性があることが分かった。ＩＬ－２３誘導活性のある分画を質量分析計で解析し、候補となるたんぱく質を同定した。
• ③リコンビナントたんぱく質を作製し、樹状細胞に添加したところＰｒｘファミリーたんぱく質に強いＩＬ－２３誘導活性を認めた。

図３　Ｐｒｘは細胞外に放出されてマクロファージを刺激する

• 発症１日目の梗塞中心における免疫染色像を示す。
• 左：Ｐｒｘ６を高発現する多量のｄｅｂｒｉｓ（壊死した組織の残骸）が存在する（緑色）。
• 中：Ｆ４／８０陽性細胞（マクロファージ）が脳内に浸潤している（赤色）。
• 右：Ｐｒｘ６を含むｄｅｂｒｉｓがマクロファージの細胞表面上に共局在している。

図４　Ｐｒｘは細胞内外で異なる働きを持つ

Ｐｒｘは過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を水（Ｈ_２Ｏ）に代謝する。虚血ストレスによって細胞内の過酸化水素が増えると、Ｐｒｘが細胞内で発現されて過酸化水素を代謝することにより、細胞を生存させる。しかし細胞が壊死すると、細胞内のＰｒｘはｄｅｂｒｉｓとともに細胞外に放出されて、脳内に浸潤したマクロファージにＴＬＲ２とＴＬＲ４を介して作用する（ＤＡＭＰｓとなる）。

図５　Ｐｒｘは共通して、炎症を誘導するための活性部位を持つ

Ｐｒｘは、ＴＬＲ２やＴＬＲ４を介して樹状細胞に炎症性サイトカインを産生させるための共通構造（矢印：α３－ｈｅｌｉｘを示す）を持つ。

図６　一過性脳虚血モデルマウスにおけるＰｒｘ抗体、ＨＭＧＢ１抗体投与の効果

脳虚血誘導直後に抗Ｐｒｘ抗体、抗ＨＭＧＢ１抗体、またはその両方を投与して、
（ａ）発症４日目の梗塞体積（染色像はＭＡＰ２染色：白い部分が梗塞巣を示す）、
（ｂ）発症直後から３日目までの神経症状の推移を示す。
　*：　Ｐ＜０．０５、* * *：　Ｐ＜０．００１　ｖｓ　対照群

図７　脳虚血における炎症を引き起こす因子としてのPｒｘの役割

脳虚血における炎症の経時変化を示す。発症６時間以内の超急性期には、虚血に陥った脳細胞からＨＭＧＢ１が放出され、これは脳血液関門の破壊に寄与する。発症１２～２４時間以内の急性期にはマクロファージの浸潤が著明になるが、ＨＭＧＢ１の放出は見られなくなる。代わりに、虚血ストレスによって細胞内で発現したＰｒｘが細胞死に伴って細胞外に放出され、浸潤したマクロファージをＴＬＲ２やＴＬＲ４依存的に活性化し、ＩＬ－２３やＩＬ－１β、ＴＮＦαを産生させる。ＩＬ－２３はさらに遅れて脳内に浸潤したＴ細胞（γδＴ細胞）からＩＬ－１７を産生させ、さらなる組織傷害を引き起こす。

＜用語説明＞

注１） ペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ：Ｐｒｘ）

ペルオキシレドキシンは、細胞毒である過酸化水素（H_２O_２）などの活性酸素種を無毒化する抗酸化酵素として、細菌や高等植物の細胞内にも存在することが知られていていた。哺乳動物ではこれまでに、６種類（Ｐｒｘ１～Ｐｒｘ６）のＰｒｘファミリーたんぱく質が同定されている。

注２） Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）

自然免疫の機能を持つ受容体。主に細菌のリポ多糖やリポたんぱく質、ウイルス由来のＤＮＡやＲＮＡを認識して細胞内シグナルを伝えることにより、さまざまな免疫応答を引き起こす。組織傷害によって放出されたＤＡＭＰｓを認識する受容体としても注目されている。

注３） ダメージ関連分子パターン（Ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ：ＤＡＭＰｓ）

組織傷害に伴って細胞から放出され、周囲の組織や細胞に危険を知らせるアラームのような役割を担う因子のこと。ＨＭＧＢ１やＨＳＰ（Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒアルロン酸、酸化型ＬＤＬなどがＤＡＭＰｓとして機能することが知られている。

注４） 一過性脳虚血モデル

脳梗塞の動物モデルとして知られている。脳血管を閉塞する方法はさまざまだが、本研究では、細い塞栓糸を頚動脈から挿入して脳血管（中大脳動脈）に到達させ、閉塞させる手技を用いている。挿入した塞栓糸を引き抜くことにより、脳血管の閉塞を解除させることができる。そのため一過性虚血再還流モデルとも呼ばれる。

＜論文名＞

“Peroxiredoxin family proteins are key initiators of post-ischemic inflammation in the brain.”
（脳虚血後の炎症惹起因子としてのｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎの役割）
doi: 10.1038/nm.2749

＜参考文献＞

＜お問い合わせ先＞

＜研究に関すること＞

七田 崇（シチタ タカシ）
慶應義塾大学 医学部 微生物学・免疫学教室　助教

吉村 昭彦（ヨシムラ アキヒコ）
慶應義塾大学 医学部 微生物学・免疫学教室　教授
〒160-8582 東京都新宿区信濃町３５　東校舎４Ｆ
Tel：03-5363-3483　Fax：03-5360-1508
E-mail：（七田）、（吉村）

＜ＪＳＴの事業に関すること＞

原口 亮治（ハラグチ リョウジ）、木村 文治（キムラ フミハル）、眞後 俊幸（シンゴ トシユキ）
科学技術振興機構 戦略研究推進部
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