本研究成果のポイント
- DNA脱メチル化の鍵物質5-ヒドロキシメチルシトシンの特異的酸化剤を発見
- DNAシーケンサで5-ヒドロキシメチルシトシンの位置の選択的検出に成功
- 細胞機能初期化のメカニズムを解くための核心的技術として期待
独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、細胞機能の初期化に関与するDNA脱メチル化過程の鍵物質と考えられている5-ヒドロキシメチルシトシン注１）をタングステン酸化剤注２）で特異的に酸化する反応を見いだし、DNA配列の中の5-ヒドロキシメチルシトシンの位置をDNAシーケンサで解析することに世界で初めて成功しました。DNA脱メチル化がゲノムのどの位置で、どのようなメカニズムで起きているのかを解明することにつながります。これは、基幹研究所（玉尾皓平所長）岡本核酸化学研究室の岡本晃充准主任研究員（JSTさきがけ研究員兼任）を中心とする研究グループの成果です。
細胞の機能は、DNAメチル化などの遺伝子発現制御機構を通じて決定づけられています。一方、遺伝子発現を回復する、もしくは細胞機能を「初期化」するためには、DNAに付加したメチル基を取り除く「DNA脱メチル化」が必要とされています。そのメカニズムはまだ解明されていませんが、1つの仮説として、脱メチル化の過程の中で5-ヒドロキシメチルシトシンが生じる可能性が指摘されています。そのため、DNA中の5-ヒドロキシメチルシトシンの検出方法がいくつか提案されつつありますが、DNAシーケンサなどDNA塩基配列を一気に調べる方法へ応用できる手法はこれまでありませんでした。
研究グループは、タングステン酸化剤がDNA中の5-ヒドロキシメチルシトシンを速やかに酸化することを見いだしました。オスミウム、レニウム、モリブデンなどタングステンと類似の金属の酸化剤では、タングステン酸化剤で見られたような高い5-ヒドロキシメチルシトシン反応性はありませんでした。タングステン酸化剤によって生じた5-ヒドロキシメチルシトシン酸化物を含むDNAを鋳型としてDNAシーケンサ解析を行うと、相補鎖側に導入される塩基がグアニンからアデニンへ変わるため、DNA配列の中の5-ヒドロキシメチルシトシンの位置を簡単に検出できることを突き止めました。この新しい化学反応は、遺伝子発現の初期化（脱分化）のメカニズムを解くための核心的技術として期待されるだけでなく、DNAメチル化、脱メチル化が鍵となるES細胞・iPS細胞についての研究にも大きく寄与していきます。
本研究は、JST 戦略的創造研究推進事業 個人型研究（さきがけ）「エピジェネティクスの制御と生命機能」研究領域における研究課題「化学基盤高性能ＤＮＡメチル化可視化系の確立」（研究者：岡本晃充）の一環として行われ、本研究成果は、英国の科学雑誌『Chemical Communications』オンライン版に近日掲載されます。
1．背景
DNAを構成する塩基の1つであるシトシン注１）のメチル化は、遺伝子発現を抑制し、細胞の機能を決定づける役割の一端を担っています。一方、シトシンが脱メチル化される（シトシンに付加したメチル基もしくは5-メチルシトシン注１）そのものを取り除いて無置換のシトシンへ戻す）と、抑制されていた遺伝子発現が回復し、細胞機能を初期化（脱分化）することが知られています。しかし、DNA脱メチル化の過程については、未解明の部分が多く残されています。2009年に、細胞内DNAに5-ヒドロキシメチルシトシンが含まれていて、特に神経細胞やES細胞などのDNAに多いことが明らかになり、5-ヒドロキシメチルシトシンが脱メチル化の過程の生成物であるという仮説が報告されました（Science、2009）。この仮説に基づき、DNA中の5-ヒドロキシメチルシトシンを検出し、その位置を特定することができると、細胞機能の初期化のメカニズムを調べることが可能となります。これまでに、5-ヒドロキシメチルシトシンを検出する方法がいくつか提案されつつありますが、DNAシーケンサなどを用いてDNA塩基配列を一気に調べ、配列のどこが5-ヒドロキシメチルシトシンへ変換されているかを特定する方法は確立できていません。
2．研究手法と成果
DNA配列中の5-ヒドロキシメチルシトシンを、無置換のシトシンや5-メチルシトシンから区別し、選択的に検出する反応を探索するために、研究グループは、5-ヒドロキシメチルシトシンのアリルアルコール注１）構造に着目しました。この構造と特異的に反応すると予想される反応剤を、これまでに開発してきた化学合成法で合成した5-ヒドロキシメチルシトシン含有DNAと混合し、反応を評価しました。その結果、タングステン酸注２）（図1）と過酸化水素の混合水溶液が効率的に5-ヒドロキシメチルシトシンを酸化することを見いだしました。この反応は、アリルアルコール構造を有しない無置換のシトシンや5-メチルシトシンに対しては起こらず、また、タングステン酸と類似の他の金属酸化剤（オスミウム、レニウム、モリブデン酸化剤）では、5-ヒドロキシメチルシトシンの酸化は効率的に進行しませんでした。一方、すでに高酸化状態にあるペルオキソタングステン二核錯体注２）は、単独でDNAの5-ヒドロキシメチルシトシンを効率的に酸化しました。
5-ヒドロキシメチルシトシンの酸化生成物を詳細に解析すると、すでにシトシン4位のアミノ基の加水分解反応が進行しており、チミン誘導体へと変化していました（図2）。このDNAを鋳型としてDNAシーケンシング解析を行うと、もともと無置換のシトシンや5-メチルシトシンがあった場所の相補鎖側にはグアニンが導入されるのに対し、5-ヒドロキシメチルシトシンがあった場所の相補鎖側にはグアニンではなくアデニンが導入されました（図3）。この手法により、5-ヒドロキシメチルシトシンの存在と位置をDNAシーケンシング解析によって選択的に検出することが可能となります。
3．今後の期待
細胞機能の初期化を解明することは、がん・老化・再生医療など、エピジェネティクス注３）技術に関わる全ての分野において、重要かつ不可欠な課題です。今回確立した、5-ヒドロキシメチルシトシン検出のための新しい化学反応は、脱メチル化をはじめとする遺伝子発現の初期化（脱分化）のメカニズムを解くための核心的技術として期待されます。特に、ES細胞・iPS細胞などリプログラミングに関わる再生医療分野や、遺伝病やがんに関わる遺伝子治療分野の飛躍的発展には、この手法を通じた5-ヒドロキシメチルシトシン解析は不可欠といえます。
＜参考図＞
図1 タングステン酸化剤（タングステン酸）
図2 5-ヒドロキシメチルシトシンの酸化と脱アミノ化
タングステン酸化反応後、5-ヒドロキシメチルシトシン4位のアミノ基の加水分解反応が進行し、チミン誘導体へと変化した。
図3 DNAシーケンシング解析の一例
配列CCCXGGGC (Xはシトシン、5-メチルシトシン、もしくは5-ヒドロキシメチルシトシン)を含むDNAを、ペルオキソタングステン二核錯体で処理した後、シーケンシング解析をした結果。処理をした後のDNAの相補鎖側に、X=シトシンもしくは5-メチルシトシンの場合にはグアニンが入るが、X=5-ヒドロキシメチルシトシンの場合にはアデニンが入った（白矢印）。この手法で、5-ヒドロキシメチルシトシンの存在と位置を検出することができる。
＜補足説明＞
- 注１） シトシン、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、アリルアルコール
- DNAを構成する塩基の1つ、シトシンは、DNAメチル転移酵素によってメチル化されて、5-メチルシトシンへ変換される。DNAプロモーター領域のシトシンがメチル化されると、その領域下流での遺伝子発現が抑制される。一部の5-メチルシトシンのメチル基が酵素によって酸化されて、5-ヒドロキシメチルシトシンへ変換されることが2009年にScienceに報告された。5-ヒドロキシメチルシトシンの構造の中の赤く示された部分がアリルアルコールに相当する部分。
- 注２） タングステン酸化剤、タングステン酸、ペルオキソタングステン二核錯体
- タングステンは、原子番号74番の希土類金属元素（レアアース・レアメタル）。タングステン酸は、H2WO4で記載されるタングステン酸化物で、水に可溶。過酸化水素などでさらに酸化すると、酸化力を有するようになり、アリルアルコールなどの炭素－炭素二重結合を酸化する酸化剤として働く。また、単独で酸化力を有するタングステン酸化剤として、ペルオキソタングステン二核錯体（下図）などが知られる。
- 注３） エピジェネティクス
- DNAメチル化やヒストンアセチル化など、ゲノムに書かれた遺伝情報であるDNA塩基配列の変化を伴わずに、遺伝子発現を活性化したり、不活性化したりする化学反応とその周辺の学問領域を指す。エピジェネティックな化学修飾は、個体発生や細胞分化の過程で重要な役割を果たし、誤った化学修飾はさまざまな疾病をもたらす。
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