ＲＮＡとたんぱく質から成るナノサイズの三角形構造体の創製に成功

＜研究背景と目的＞

生体分子の中で、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびたんぱく質については、分子レベル、原子レベルでの研究が進んでいます。ＤＮＡの場合は、ＤＮＡのもつ単純な二重らせん構造を基本として分子デザインが行われており、ＤＮＡオリガミ^注１）という高度に複雑な構造体などの大きなサイズの分子の構築が報告されています。しかしＤＮＡは、あくまでも二重らせん構造を基本とする制約があり、構造体形成のための材料としての構造単位に限界があると考えられます。特に、生体内で作用する小さなサイズ（例えば通常の酵素以下の大きさ）で複雑な機能と構造を持つ分子の作成には適しません。また、生体内で酵素などの機能性分子として働くものはなく、機能的にも構造的にも自由度が少ないのが現状です。一方、ＲＮＡは二重らせん構造に加えて、さまざまな分子内および分子間相互作用が可能であるため、この性質を利用して生体内で多様な立体構造を形成し、酵素機能などの高度な機能を発揮することが知られています。また、たんぱく質はＲＮＡよりはるかに多彩かつ複雑な立体構造と機能を有しますが、その複雑さのため、分子設計は非常に困難です。そこで、ＲＮＡは設計により作成し、たんぱく質は天然のものを利用するといった戦略で、設計の柔軟性が高くかつ複雑な立体構造や機能を持つ分子を設計するのが合理的と考えられます。しかし、これまでの国内外の研究においてＲＮＡとたんぱく質の複合体（ＲＮＰ）^注２）を利用したナノ構造体の構築や、たんぱく質により構造を制御できる人工ナノ構造体の構築は達成されておらず、そのため複雑な構造や、微細な構造の作成技術の開発はほとんど進んでいませんでした。

＜研究の内容＞

本研究では、ＲＮＡ分子上に複数の機能性たんぱく質の結合を可能にする、ＲＮＰ分子デザイン技術を開発しました（図１）。特定のたんぱく質にだけ結合しやすいＲＮＰモチーフ^注３）が必須なため、リボソームたんぱく質Ｌ７Ａｅ^注４）と、それに特異的に相互作用するキンクターンＲＮＡ^注５）を選択しました。このキンクターンＲＮＡはＬ７Ａｅと結合する（図２の黄色の部分）と約６０度の角度に折れ曲がります（図２の赤い部分）。この特徴的なＲＮＰは、ナノサイズの構造体を作成するための新しいパーツとして有用である可能性があります。このＲＮＰを利用して、人工のＲＮＰから成るナノ正三角形（Ｔｒｉａｎｇｌｅ－ＲＮＰ）を作成しました。具体的には、一辺が１０－３０ｎｍというナノ（１０億分の１）メートルサイズの三角形を構築するため、キンクターンＲＮＡのモチーフを３ヵ所に持つ環状の二本鎖ＲＮＡを設計して、これにＬ７Ａｅを結合させる実験を行ないました（図３・左）。

その構造体形成を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により観察すると、３つのＬ７Ａｅ－キンクターンＲＮＡがそれぞれの頂点部分を形成する一辺が約１７ｎｍの三角形構造体が完成していました（図３・右）。たんぱく質の存在下でのみ、三角形様の構造体が観察されたことから、たんぱく質によりＲＮＡの構造を人工的に制御する世界初の構造制御に成功したことが分かりました。また、辺にあたる部分のＲＮＡの塩基数（長さ）を２６ｂｐから４８ｂｐに増やすことで一辺が２３ｎｍのよりサイズの大きな三角形をデザインし、同様にこのＲＮＡとＬ７Ａｅを結合させたところ、予想通り大きな三角形が観察されました。 これらの結果は、ＲＮＰモチーフを切り貼りすることで、ナノ構造を容易に設計できることを示しています。

さらに、３つの頂点に目的の機能性たんぱく質を配置するため、Ｌ７Ａｅとの融合たんぱく質として、緑に光るＥＧＦＰ蛍光たんぱく質を同様の方法で結合させ、ＡＦＭにより観察してみました。その結果、３つの機能性たんぱく質を頂点に持つ三角形が構築できていることが分かりました（図４）。 また、細胞内の環境に類似した生理条件下でも、この構造体は安定に保持できることが明らかになりました。

＜今後の展望＞

本研究の成果より、三角形の頂点それぞれに例えばがん細胞を認識する２種類のたんぱく質と細胞を殺傷する１つのたんぱく質を結合すれば、特定のがん細胞を間違いなく認識し、これにより検出されたがん細胞のみを殺傷するといった複数の機能を持つ有用な高機能ＲＮＰ分子の創製が期待できます。また、ナノバイオテクノロジー分野にＲＮＡ－たんぱく質複合体が活用できることを初めて示すものであり、細胞内で目的の機能をもつ構造体を自在に作り出せるため、必要なときに必要な「分子機械」を構築する基盤技術としても期待されます。

細胞内のたんぱく質合成工場であるリボソーム^注６）に代表される天然の超機能性分子は、複数のＲＮＡとたんぱく質が自己集合することで複雑な構造体を形成し、高度な機能を発現しています。近年、生体分子を活用してナノサイズの構造体を作成する研究が注目されていますが、このような複数の分子から成る機能性ナノ構造体の作成は、これまで実現できておりませんでした。本技術の発展により、そのような機能性構造体の創出が可能になることが期待できます。さらに、機能や構造を環境に応答して変換できる、インテリジェントな人工分子を創出するには至っていませんでしたが、本研究の基盤技術である「ＲＮＰ分子デザイン」は、より複雑な構成を持つナノサイズの構造体を作成できるとともに、さらにはその構造をも動的に制御できるインテリジェントな分子作成技術です。将来的には構造変換によりＲＮＰ分子機械の機能を制御できる可能性も十分にあると考えられ、リボソームに匹敵する、高度に複雑で洗練された機能性分子複合体やナノロボットを創出する可能性を秘めています。

本技術で創製した分子は、あらゆる生物に適用可能であるため、生物学研究や医療、検査などに用いる新しい機能性複合体分子の開発が可能になると考えられます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） ＤＮＡオリガミ

２００６年にカリフォルニア工科大学のＰａｕｌ Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ博士により初めて報告された、約７０００塩基の長い１つのＤＮＡと、その構造を規定する数百本の短い留め金ＤＮＡを用いてナノ構造体を設計し、作成する技術のこと。ＤＮＡオリガミでこれまでに作成された構造体に対し、本研究成果で作成したナノ構造体は約１０－３０ｎｍスケールと比較的小さい。

注２） ＲＮＡとたんぱく質の複合体（ＲＮＰ）

細胞内に存在するＲＮＡの多くは、単独で機能を発現することはなく、たんぱく質との複合体（ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＲＮＰ）として、存在している。このように生体内で重要な役割を果たすＲＮＰを人工的に設計し、構築する技術は、これまでに達成されていなかった。

注３） ＲＮＰモチーフ

ＲＮＡ－たんぱく質の相互作用の基盤となる、生物種又は分子を超えて保存された配列と構造を持つＲＮＰの構成ユニットのこと。このＲＮＰ相互作用モチーフは、比較的単純で短い配列をもち、それ自身独立かつ安定な立体構造を形成できる場合が多い。

注４） Ｌ７Ａｅ

古細菌リボソーム大サブユニットに存在するたんぱく質の１つであり、リボソーム構築に必須の因子であるとともに、ＲＮＡ塩基の修飾や、ＲＮＡを基盤とする遺伝子発現システムであるリボスイッチへの結合など、複数の機能を担う。本研究で用いたキンクターンＲＮＡと強固に結合し、ＲＮＡの構造変化を誘導する性質を持つ。

注５） キンクターンＲＮＡ

リボソームＲＮＡ中で発見された、天然ＲＮＡ－たんぱく質の構造形成に重要な役割を果たすＲＮＡモチーフの１つ。Ｌ７Ａｅが結合することで、ＲＮＡの構造変化（キンク）が誘導され、６０度に折れ曲がる。このＲＮＰは、結合親和性と特異性が高く、安定な複合体を細胞内外で保持できる。

注６） リボソーム

全ての生物の細胞内に存在し、生存に必須の機能性超分子複合体である。ｍＲＮＡの遺伝情報を読み取ってたんぱく質へと変換する機構である翻訳が行われる場である。大小２つのサブユニットからなり、これらは５０種類以上のたんぱく質（リボソームたんぱく、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）と少なくとも３種のＲＮＡ（リボソームＲＮＡ、ｒＲＮＡ；ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ）の複合体である。２０００年、Ｘ線構造解析により立体構造が決定され、キンクターン ＲＮＡを含む、さまざまなＲＮＰモチーフが見つかっている。

＜論文名＞

“Synthetic RNA-protein complex shaped like an equilateral triangle”
（人工ＲＮＡ－たんぱく質複合体を基盤とした正三角形構造体の創出）
doi: 10.1038/nnano.2010.268

＜お問い合わせ先＞

＜研究に関すること＞

齊藤 博英（サイトウ ヒロヒデ）
京都大学 次世代研究者育成センター（白眉プロジェクト）　特定准教授
科学技術振興機構　戦略的創造研究推進事業 総括実施型研究（ＩＣＯＲＰ）
「ＲＮＡシンセティックバイオロジープロジェクト」　グループリーダー
〒606-8502 京都府京都市左京区北白川追分町
Tel：075-753-3997　Fax：075-753-3996
E-mail：

＜ＪＳＴの事業に関すること＞

小林 正（コバヤシ タダシ）
科学技術振興機構　イノベーション推進本部 研究プロジェクト推進部
〒102-0075 東京都千代田区三番町５ 三番町ビル
Tel：03-3512-3528　Fax：03-3222-2068
E-mail：