藍藻の「時計たんぱく質」のリズミカルな構造変化を解明－分子時計の鼓動が聴こえる

ＪＳＴ課題解決型基礎研究の一環として、名古屋大学大学院理学研究科の近藤孝男　教授と秋山修志　講師らは、藍藻の時計たんぱく質^注１）が、あたかも心臓が拍動するかのように形状をリズミカルに膨張・収縮させ、２４時間周期で時を刻むことを明らかにしました。

藍藻（シアノバクテリア）は生物時計を備えた最も下等な生物で、その時計は３種類の時計たんぱく質（ＫａｉＡ、ＫａｉＢ、ＫａｉＣ）からなります。本研究グループは、これまでの研究から、この３つの時計たんぱく質をＡＴＰ^注２）存在下で混合すると、ＫａｉＣのＡＴＰ加水分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）活性やリン酸化状態が２４時間周期で振動することを示してきました。このことは、ＫａｉＣのＡＴＰａｓｅ活性が生物時計の周期を規定する重要な因子であると考えられ、ＡＴＰａｓｅ活性の増減に伴ってＫａｉＣの分子形態がどのように変動するのか、その分子機構の解明が期待されていました。

研究グループは今回、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８^注３）の理研構造生物学ビームラインＩ（ＢＬ４５ＸＵ:Ｘ線小角散乱法^注４））や蛍光分光法を用いて、溶液中のＫａｉＣ分子が２４時間周期で形状をリズミカルに変化させることを解明しました。ＫａｉＣは、ドーナツを２つ積み上げたような二重のリング状構造をしていますが、片方のリングにあるＡＴＰａｓｅの制御状態と密に連動して、もう片方のリング半径が大きく膨らんだり、縮んだりを繰り返します。ＫａｉＡやＫａｉＢはこの膨張・収縮を感知することで、ＫａｉＣと結合・解離するタイミングを計っています。ＡＴＰａｓｅの基準信号をＫａｉＣの構造変化へと変換し、さらにそれを通じてＫａｉＡやＫａｉＢの結合・解離と連動させることで、より頑強で安定な２４時間振動を実現しているものと考えられます。

本研究によってＫａｉＣの構造変化の一端が解明され、ＫａｉＣがＡＴＰａｓｅ活性の自己制御を通じてどのように２４時間周期を実現しているのかを解明するための分子基盤が整備されました。シアノバクテリアで解明されつつあるＡＴＰを使った分子時計のフレームワークは今後、人間を含めた高等生物の時計研究の手がかりになるものと期待されます。

本研究成果は、２０１０年１１月２６日（英国時間）に欧州科学雑誌「ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ」のオンライン速報版で公開されます。

本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。

戦略的創造研究推進事業チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）

研究領域	：	「生命システムの動作原理と基盤技術」（研究総括：中西重忠　（財）大阪バイオサイエンス研究所　所長）
研究課題名	：	「シアノバクテリアの概日システム」
研究代表者	：	近藤孝男（名古屋大学大学院理学研究科　教授）
研究期間	：	平成１９年１０月～平成２５年３月

ＪＳＴはこの領域で、生命システムの動作原理の解明を目指して、新しい視点に立った解析基盤技術を創出し、生体の多様な機能分子の相互作用と作用機序を統合的に解析して、動的な生体情報の発現における基本原理の理解を目標としています。上記研究課題では、シアノバクテリアの概日システムに関する研究を通じて、細胞内における機能分子の動的自己制御機構の解明を目指しています。

＜研究の背景と経緯＞

多くの生物に見られる生物時計は、代謝や光合成といった重要な生命活動を昼夜環境サイクルに同調させるための基礎的な制御機構です。時計機能を支える時計たんぱく質や遺伝子が損傷を受けると、細胞内の広範な生理活性調節にまで障害が及び、重篤な病気の引き金となることが指摘されています。生物時計の動作原理について理解を深めることは、私たち人間を含めた生物の生活の質を維持向上させることにつながります。

シアノバクテリアは生物時計を備えた最も下等な生物で、その時計は３種類の時計たんぱく質（ＫａｉＡ、ＫａｉＢ、ＫａｉＣ）からなります。３つの時計たんぱく質とＡＴＰを試験管内で混合すると、ＫａｉＣのＡＴＰａｓｅ活性やリン酸化状態が２４時間周期で振動します。これまでの研究から、ＫａｉＣのＡＴＰａｓｅ活性が生物時計の周期を規定する重要な因子であることが強く示唆されていました。ＫａｉＣがペースメーカーの役割を担うなら、他の時計たんぱく質に時刻情報を伝えるため、ＫａｉＣは自ら状態や構造を変化させると予測されます。しかし、すでに解明されていたＫａｉＣのＸ線結晶構造からは、その変化を捉えることができませんでした。本研究グループはその理由を、時を刻むＫａｉＣの構造は柔軟であるため、結晶という形態に整列させると分子の本来あるべき姿が損なわれるからではないかと考えました。

＜研究の内容＞

本研究グループの秋山講師らは今回、これまでにＪＳＴ個人型研究（さきがけ）「生命現象と計測分析」（研究総括：森島績）研究領域における研究課題「時間と共に離合集散を繰り返す分子機械のＸ線小角散乱・動的構造解析」で培ったＸ線小角散乱による動的構造解析法を駆使し、ＡＴＰａｓｅ活性に連動したＫａｉＣの形状変化を結晶ではなく溶液中で詳しく検証しました。

ＫａｉＣを溶液に入れ、その状態を実時間で追跡したところ、ＡＴＰａｓｅ活性、リン酸化状態、分子形状を互いに連動させつつ、ＫａｉＣが４つの状態を経由することが明らかになりました（図１）。ＫａｉＣの二重リング状構造のうち、Ｃ１リングのＡＴＰａｓｅ活性と密に連動して、Ｃ２リングが大きく膨張・収縮を繰り返します。この状態変化はＫａｉＣ単独で調べたものですが、実際にＫａｉＡやＫａｉＢが共存する振動反応においても、ＫａｉＣが同様の構造転移を起こすことが蛍光分光法で確認されています（図２）。

これらはＫａｉＣの構造変化を捉えた世界初の観察であり、ＫａｉＣがペースメーカーの役割を担っていることを強く支持します。Ｃ２リングの膨張は、ＫａｉＡやＫａｉＢをＫａｉＣに引きつけるタイミング信号の役割も兼ねており、安定なＫａｉＡ：ＫａｉＢ：ＫａｉＣ複合体の形成を促します（図３）。ＡＴＰａｓｅ活性から来る基準信号をＣ２リングの形状変化へと変換し、さらにそれを通じてＫａｉＡやＫａｉＢの結合・解離と連動させることで、より頑強で安定な２４時間発振を実現しているものと考えられます。

＜今後の展開＞

今回の成果は、Ｋａｉたんぱく質時計の中核をなす振動子が「チクタク…」と時を刻む様子を捉えたものであり、時計機能を発現するための基本要素がＫａｉＣに内包されていることを強く支持するものです。今後、ＡＴＰａｓｅ活性とＫａｉＣの鼓動をリンクする仕組みについて分解能を空間と時間の両次元に高めつつ検証することで、「２４時間を規定する構造生物学的からくり」に迫ることができると期待されます。今のところ、ＫａｉＣのような機能を有するたんぱく質が見いだされているのはシアノバクテリアのみですが、ＡＴＰを使ったタイミング制御は人間を含めた高等生物でも姿形を変えて存在している可能性があり、今後の生物時計研究の手がかりになるものと期待されます。

＜参考図＞

図１　ＫａｉＣのＡＴＰａｓｅ活性と共役したＣ２リングの膨張・収縮運動

灰色部分はＸ線小角散乱により解明されたＫａｉＣの分子形状を表す。リボンモデルはＸ線小角散乱の実験データに合致するよう、既知のＸ線結晶構造を使って構築した高分解能分子モデル。Ｗ３３１およびＷ４６２は、Ｃ２リングのトリプトファン残基の位置を示している。各モデルの直下には、Ｃ２リングのみを投影した等高線図が示されている。ＡからＢ状態への変化ではＣ２リングの大きさはあまり変化しない。しかしＢからＣ状態へ遷移する際、Ｃ２リング半径が大きく膨らむことが、等高線図の谷が深くなっている点からも読み取れる。
Ｃ２リングの膨張収縮運動はＣ１リングのＡＴＰａｓｅ活性の増減と共役している。

図２　ＫａｉＣはＣ２リングを膨張・収縮させつつ時を刻む

ＫａｉＡやＫａｉＢが存在する条件下で、ＫａｉＣのＣ２リングにあるトリプトファン残基（図１：Ｗ３３１およびＷ４６２）の蛍光強度の変化を計測した。図中のＫａｉＣに記されている星印の大小は、トリプトファン残基からの蛍光強度の大小を模式的に表現している。
図１に示されるようなＣ２リングの膨張収縮具合に応じ、Ｗ３３１やＷ４６２の強度も２４時間の周期で増減を繰り返す。

図３　Ｋａｉたんぱく質時計の反応サイクルの模式図

Ｃ１リングにあるＡＴＰａｓｅの制御状態は、Ｃ２リングの膨張収縮状態と共役しており、その分子鼓動を指針にＫａｉＡやＫａｉＢは離合集散のタイミングを計っている。結合したＫａｉＡやＫａｉＢはＡＴＰａｓｅ活性に変調を与え、反応サイクルをより力強く安定に保っている。

＜用語解説＞

注１）時計たんぱく質: 生物が時計機能を維持するために必須となるたんぱく質の総称である。時計たんぱく質の変異や欠損により、生物のさまざまな行動において、リズム特性が変調を受ける。
注２）ＡＴＰ: アデノシン三リン酸（ＡｄｅｎｏｓｉｎｅＴｒｉｐｈｏｓｈａｔｅ）のことで、筋肉が収縮するときなどにエネルギー源として利用される物質。生物体で用いられるエネルギー保存および利用に用いられるヌクレオチドであり、その生物体内の存在量や物質代謝における重要性から「生体のエネルギー通貨」と呼ばれる。アデノシンという物質に３つのリン酸基が結合した形をしているが、ＡＴＰ加水分解酵素の働きによって、リン酸基がはずされて分解される。１つのリン酸基がはずれる毎に、約８ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギーを放出する。
注３）大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ－８: 兵庫県の播磨科学公園都市にある世界最高輝度の放射光を生み出す、理化学研究所の共同利用施設。その名前は、ＳｕｐｅｒＰｈｏｔｏｎ ｒｉｎｇ－８ＧｅＶに由来する。放射光とは、電子を光とほぼ等しい速度まで加速し、電磁石によって進行方向を曲げた時に発生する、細く強力な電磁波のこと。ＳＰｒｉｎｇ－８では、この放射光を用いて、物理、化学、地学などの基礎研究から、ナノテクノロジー、バイオテクノロジーや産業利用まで幅広い研究が行われている。; ＳＰｒｉｎｇ－８ホームページ　http://www.spring8.or.jp/ja/
注４）Ｘ線小角散乱法: Ｘ線を物質に照射して散乱するＸ線のうち、散乱角が小さいものを測定することにより物質の構造情報を得る手法で、たんぱく質や核酸などの生体高分子、微粒子や液晶、合金の内部構造といった数ナノメートルレベルでの構造解析に用いられる。