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平成21年12月28日

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藤田保健衛生大学
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大脳新皮質に新しい神経前駆細胞を発見

―成熟ラットで神経新生も確認、てんかんなどの新治療法への応用に期待―

JST目的基礎研究事業の一環として、藤田保健衛生大学 総合医科学研究所の大平 耕司 助教らは、大脳新皮質注1)に新しい神経前駆細胞注2)を発見しました。この細胞から神経が新生することも確かめました。

これまでに、記憶の形成に重要な海馬や側脳室の脳室下帯では、大人になっても神経細胞が作られることが明らかになっています。一方、認識・思考・意識などといった高度な脳機能を生みだす大脳新皮質において、大人になっても神経新生注3)が生じるかどうかは、100年以上前から議論が続く大きな問題でした。

本研究グループは今回、細胞分裂している細胞に蛍光たんぱく質を作らせることにより、新しい神経細胞を作ることができる神経前駆細胞がラットの大脳新皮質の表層に存在することを発見しました。さらに脳に虚血(脳虚血)注4)を起こすと、この細胞は、てんかんや過剰な神経活動を抑えることのできる抑制性神経細胞注5)を盛んに産生することも分かりました。「大脳新皮質の第1層にある神経前駆細胞」という英語の頭文字を連ねて「L1−INP細胞」と名付けました。

今後、虚血によらずとも、薬剤などの投与により、これらのL1−INP細胞の増殖や新しく産生された神経細胞の生存を促進させることで、てんかんや認知機能の低下を防ぐ新しい治療法の確立につながる可能性があります。また、統合失調症などの精神疾患では大脳新皮質の抑制性神経細胞が減少する中間表現型注6)が知られていますが、抑制性神経細胞を増殖・維持させることにより、精神疾患の治療にも結びつく可能性を持っています。

本研究成果は、2009年12月27日(米国東部時間)に米国科学雑誌「Nature Neuroscience」のオンライン速報版で公開されます。

本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。

戦略的創造研究推進事業 チーム型研究(CREST)

研究領域 「精神・神経疾患の分子病態理解に基づく診断・治療へ向けた新技術の創出」
(研究総括:樋口 輝彦 国立精神・神経センター 総長)
研究課題名 マウスを活用した精神疾患の中間表現型の解明
研究代表者 宮川 剛(藤田保健衛生大学 総合医科学研究所 教授)
研究参加者 大平 耕司(藤田保健衛生大学 総合医科学研究所 助教)
研究期間 平成19年10月〜平成25年3月

JSTはこの領域で、少子化・高齢化・ストレス社会を迎えた日本において社会的要請の強い認知・情動などをはじめとする高次脳機能の障害による精神・神経疾患に対して、脳科学の基礎的な知見を活用し予防・診断・治療法などにおける新技術の創出を目標にしています。

上記研究課題では、精神疾患モデルマウスの脳について、各種先端技術を活用した網羅的・多角的な解析を行い、生理学的、生化学的、形態学的特徴の抽出を進め、さらに、これらのデータをヒトの解析に応用することによって、精神疾患における本質的な脳内中間表現型の解明を目指します。

<研究の背景と経緯>

大人の脳は、非常に再生しにくいことが昔からよく知られています。そのため、事故や疾病による脳の損傷により、多くの人たちが後遺症を抱えたまま一生を過ごさなければならず、患者のQOL(生活の質)の低下や家族の負担も甚大なものとなっており、一刻も早い治療法の確立が望まれています。

一方、近年になり、大人の脳でも新しい神経細胞が盛んに作られることが、記憶に関連する海馬の歯状回や、においの感覚を伝える嗅球の神経細胞が作られる側脳室の脳室下帯で明らかになっています。これらの領域に存在する神経細胞の元になる神経幹細胞注2)や前駆細胞を利用して、体外で増殖・分化させた後に損傷した脳の領域に移植する方法を開発する試みが行われています。また、再生医療で注目されている人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いた脳・神経系の治療法開発の試みも同じ論理に基づいています。しかし、損傷部位に存在する神経細胞の種類は多岐にわたるため、幹細胞から目的の神経細胞だけに分化させることが困難です。増殖細胞の移植によるがん化などの問題もあり、体外からの細胞移植による脳損傷・疾患の治療法は、まだ開発途上にあるのが現状です。

脳損傷に対する治療法のもう1つの柱と考えられているのは、もともと脳内に存在する神経幹細胞や前駆細胞を利用して、体内に存在したまま増殖・分化させる治療法です。この治療法を確立するためには、対象となる脳の領域に存在する神経幹細胞や前駆細胞を同定することが必須となります。最近の研究により、損傷によって大脳新皮質における神経細胞の新生が報告されており、脳内に大脳新皮質の神経細胞を産生する神経幹細胞や前駆細胞が存在するのではないかと推測されていました。しかし、成熟期の大脳新皮質の神経幹細胞や前駆細胞が、どこに存在し、どのような性質を有しているのか、これまで全く明らかにされていませんでした。

また大脳新皮質は、認識、思考、意識など脳の高次機能の中心であり、大人の大脳新皮質でも神経細胞が作られるかどうかは100年以上前から議論の続く重要な問題ですが、はっきりとした証明はされていませんでした。従って、大人の大脳新皮質において神経幹細胞や前駆細胞を同定することは、基礎科学と臨床医学にとって非常に重要なことになります。

<研究の内容>

本研究グループは今回、成熟したラットの大脳新皮質の表層(第1層)に神経細胞を生み出す神経前駆細胞(L1−INP細胞)を発見しました。さらに、L1−INP細胞は、前脳虚血を起こすと盛んに分裂し、抑制性神経細胞を産生しました。また、ラットの行動実験で、新しく作られた抑制性神経細胞が神経回路に組み込まれていることを明らかにしました。以下、それぞれの項目について詳述します。

1)大脳新皮質第1層の分裂細胞

まず、細胞分裂マーカーであるKi67の全脳マッピングを行った結果、大脳新皮質第1層にKi67陽性細胞が集積していることを見いだしました。さらに、多種の細胞マーカーとの多重免疫染色により、第1層分裂細胞は、抑制性神経伝達であるGABAを合成する酵素であるGAD67を含有していることを明らかにしました。GAD67は、海馬と脳室下帯の神経幹細胞や前駆細胞にも発現しているため、第1層分裂細胞に注目しました。

2)レトロウイルスを利用した第1層分裂細胞の解析

第1層分裂細胞と分裂して生まれた新生細胞の形態を詳細に解析できるように、膜移行性緑色蛍光たんぱく質(GFP)を発現するレトロウイルスベクター注7)を作製しました。このレトロウイルスベクターを第1層分裂細胞に感染させて多重免疫染色を行い、第1層分裂細胞が球型の細胞で2、3本の短い突起を持っていることを明らかにしました。また、軽度な脳虚血を起こすと第1層分裂細胞は盛んに増殖することが分かりました(図1)。

3)新生細胞についての解析

第1層分裂細胞から生まれた新生細胞の移動について時間を追って解析すると、第1層から深層(第6層)へ7〜10日で到達することが明らかになりました(図2)。新生細胞は、ほぼ全て一様の形態学的な特徴を示し(図3)、新生細胞を多重免疫染色すると、約80%は、GABA陽性の抑制性神経細胞に分化することを見いだしました(表1)。その他に、新しく産生された神経細胞は、ニューロペプチドY注8)(約30〜40%)、ソマトスタチン注8)(約10%)などを発現していることが分かりました。また、グリア細胞のマーカーを使用して多重免疫染色を行いましたが、新生細胞は全く染色されませんでした。この結果、新生したのは神経細胞で、グリア細胞の新生はないと言えます。新生神経細胞の神経回路への組み込みについて解析するために、ラットの新規探索行動課題注9)を利用しました。探索行動によって活動した神経細胞は、神経興奮のマーカーであるc-Fosを発現しますので、GFPとc-Fosを共に発現している細胞は、回路に組み込まれている新生細胞と言うことができます。ウイルスベクター感染後、虚血を起こして神経細胞新生を誘導し、さらに1ヵ月経過したラットを回転車やトンネルを入れて環境を豊かにした新しいケージに移し、新規探索行動をさせると、大脳新皮質内にGFPとc-Fosを共に発現している細胞が出現しました。この結果は、新しく生まれた神経細胞が脳の神経回路に組み込みまれていることを示唆しています。

以上の結果から、大脳新皮質第1層に神経前駆細胞(L1−INP細胞)が存在することを世界で初めて実証しました。(図4)。

<今後の展開>

新生神経細胞に含有されているニューロペプチドYとソマトスタチンには、神経細胞の活動を抑制することにより、神経回路の異常な電気的興奮状態であるてんかんを抑える機能があります。今回、新生神経細胞の80%がGABA作動性であったことから、L1−INP細胞の増殖・分化、新生神経細胞の生存を薬剤などで制御することができれば、脳卒中が原因で起こるてんかんやそれに付随する認知機能の低下を防ぐ治療法の開発につながることが期待されます。

また、統合失調症などの精神疾患では、大脳新皮質において、抑制性神経細胞の数が有意に低下する中間表現型が知られていますが、抑制性神経細胞を増殖・維持させることができれば、精神疾患に対する新しい“細胞治療法”に結びつく可能性もあります。

<付記>

本研究は、京都大学 大学院医学研究科の金子 武嗣 教授、東京農工大学 工学府の中村 俊 教授らと共同で行われました。

<参考図>

図1

図1 虚血処理による第1層分裂細胞(L1−INP細胞)の増加

A: 健常ラットと虚血処理ラットの脳断面の模式図。赤丸はL1−INP細胞、緑丸は L1−INP細胞以外の分裂している細胞をそれぞれ示しています。

B: L1−INP細胞は、健常ラットの脳中ではほとんど増殖していませんでしたが、虚血処理したラットでは有意に増加していました。

図2

図2 L1−INP細胞から産生された新生細胞の移動

A: 虚血後の時間が経過するにつれて、GFP陽性の新生細胞が、次第に大脳新皮質の深部に観察されました。矢頭は、その期間での最も深部に存在するGFP陽性の新生細胞、矢印は下に拡大した細胞をそれぞれ示しています。

B: GFP陽性新生細胞の大脳新皮質内での相対位置をグラフ化したもの。大脳新皮質表面を0、第6層と白質の境界部を1、とした時の相対値で示しています。

図3

図3 新生細胞の形態

新生細胞のほとんどは、均一の形態学的特徴を示しました。10ミクロンほどの球型の細胞体、複数の複雑な樹状突起様の突起、1本長く伸びる軸索様の突起(矢頭)を有していました。

表1

表1 新生細胞の分化についての解析

GFP陽性細胞に対するそれぞれの分子マーカーの発現の割合で示しています。抑制性神経細胞のマーカーであるGABAを多く含んでいました。グリア細胞マーカー(GFAP、オリゴデンドロサイト膜、CD11b)は全くGFPと共染色されませんでした。

図4

図4 本研究のまとめ

L1−INP細胞は、虚血刺激により盛んに増殖し、抑制性神経細胞を産生します。新しく生み出されてきた抑制性神経細胞は、神経細胞の活動を抑制する働きを持つニューロペプチドYやソマトスタチンを発現しているので、既存の神経回路網に組み込まれた後、虚血が原因で起こるてんかんや認知機能の低下を防ぐ役割を担っている可能性があります。従って、L1−INP細胞や新生抑制性神経細胞の増殖・分化・生存が制御できれば、てんかん、認知機能の低下、精神疾患に対する細胞を使った新しい治療法の開発に結びつく可能性があります。

<用語解説>

注1) 大脳新皮質
大脳新皮質は、認識、運動、思考、記憶、意識などの脳高次機能と密接に関連しており、ほ乳類になってから非常に発達した薄いシート状の構造で、脳の表面に位置しています。大脳新皮質は、垂直方向に、細胞構築によって区別される6層構造を持っています(本研究で用いたラットの大脳新皮質は、約2mmの厚さです)。また、水平方向も細胞構築が異なる領域が存在していて、感覚、運動、言語、認知などの機能がそれぞれの領域に局在しています(これを機能局在と言います)。
注2) 神経前駆細胞、神経幹細胞
神経幹細胞は、未分化な性状を保ったまま増殖できる自己複製能と、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することができる多分化能の両方を有しています。神経幹細胞からは、自己複製能を持つ少し分化した前駆細胞が分裂してきます。神経前駆細胞からは神経細胞、グリア前駆細胞からはグリア細胞が生み出されます。つまり、神経幹細胞>神経前駆細胞>神経細胞、あるいは神経幹細胞>グリア前駆細胞>グリア細胞、という脳内の細胞について分化経路が存在します。
注3) 神経新生
脳の中には、1,000億個のニューロン(神経細胞)と、その10倍の数のグリア細胞(神経膠細胞)が存在し、精密なネットワークを形成しています。ネットワーク構築のためには、脳の細胞の元になる細胞(神経幹細胞)が多数分裂して数を増やし、ニューロンやグリアの細胞に分化することが必要です。この過程を「神経新生」(もしくはニューロン新生)と呼んでいます。
注4) 虚血(脳虚血)
脳卒中(脳梗塞、脳出血、くも膜下出血)や脳の外傷、一過性心肺機能停止後の蘇生により、脳の一部または全体が、一過性にあるいは永久的に血液が脳に行き渡らない状態のことを虚血といいます。虚血状態になると、脳のエネルギー源であるグルコースや酸素の供給が絶たれてしまうために、その領域の神経細胞の生存が維持できなくなり死滅します。
注5) 抑制性神経細胞
神経細胞の活動電位の発生を抑制する神経細胞を指します。中枢神経系を構成する神経細胞の約20〜30%を占めています。この細胞は、刺激を受けて興奮すると、神経伝達物資として、GABAあるいはグリシンを放出します。中枢神経系のシナプスの約30%がGABA伝達性です。一方、グリシンは、脳幹と脊髄で主要な抑制性伝達物質です。
注6) 中間表現型
精神医学の概念の1つで、遺伝的に規定される要因の大きい生物学的特徴を指し、遺伝子と表現型の間に位置づけられます。精神疾患は、診断の決め手となる生物学的な検査はほとんどなく、既往歴や症状を、医師が患者さんとの会話などを通して総合的に評価して診断します。最近になり、生物学的な指標である中間表現型をもって診断する試みが行われるようになってきました。たとえば、統合失調症の中間表現型として、作業記憶の障害などがあります。
注7) レトロウイルスベクター
レトロウイルスはRNAウイルスの一種で、細胞に侵入後、遺伝子RNAがウイルス粒子内の逆転写酵素によって一度DNAに逆転写されて、ウイルス由来の遺伝子が細胞の染色体に組み込まれる生活史を持っています。また、レトロウイルスの重要な特徴として、分裂細胞に特異的に感染することが挙げられます。今回の研究では、レトロウイルスの自己増殖能や病原・感染性をコードする遺伝子を取り除いた安全性の高いレトロウイルスベクターを用いて、発現させたい遺伝子(GFP)を組み込み、それをラットの脳内に導入して分裂細胞に発現させました。
注8) ニューロペプチドY、ソマトスタチン
ニューロペプチドYとは、神経ペプチドの1つで、視床下部においては摂食行動やエネルギー調節に関係しています。また、大脳新皮質をはじめ脳内に豊富に発現しており、不安、鬱、てんかんなどへの関係が示唆されています。
ソマトスタチンも神経ペプチドの1つで、脳内に広く分布しています。脳下垂体における成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモンの分泌抑制をはじめ、アルツハイマー病や精神疾患患者の大脳新皮質で顕著に減少していることから、脳の高次機能にも関係しています。
注9) 新規探索行動課題
げっ歯類には、新しい環境下に置かれたときに、盛んにその環境がどのようなものであるのか、五感を使って探索する性質があります。その性質を利用して、動物が新しい環境に置かれたときに示す探索行動を指標にした課題のことです。本研究では、新規探索行動課題後に、ヒゲの感覚が大脳新皮質に入力する部位である体性感覚野で新生した神経細胞の免疫染色を行っています。

<論文名>

“Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells”
(大脳新皮質第1層分裂細胞による虚血依存的な神経新生)
doi: 10.1038/nn.2473

<お問い合わせ先>

<研究に関すること>

大平 耕司(オオヒラ コウジ)
藤田保健衛生大学 総合医科学研究所 システム医科学研究部門 助教
〒470-1192 愛知県豊明市沓掛町田楽ヶ窪1−98
Tel:0562-93-9383 Fax:0562-92-5382
E-mail:

<JSTの事業に関すること>

河村 昌哉(カワムラ マサヤ)
科学技術振興機構 イノベーション推進本部 研究領域総合運営部
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