筋ジストロフィー患者由来のｉＰＳ細胞における遺伝子修復に成功

＜研究の背景と経緯＞

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ヒトＸ染色体上に存在するジストロフィン遺伝子の機能欠損により引き起こされる進行性筋萎縮症で、男児出生約３，５００人に１人の割合で発症します。乳児期には明らかな症状は現れず、多くは３歳から５歳頃から筋力低下は徐々に進み、１０歳前後から１２歳までには歩行不能となり車椅子での生活になります。１０歳代後半から２０歳前後で筋力低下による呼吸不全、心不全が見られるようになり、有効な治療法もなく死に至ります。そのため、より早く遺伝子治療などの治療法が確立することを期待されています。

ジストロフィン遺伝子は全長２．４Ｍｂ^注３）にも及ぶ巨大な遺伝子です。少なくとも７つのプロモーターに制御され、１８種のスプライシングアイソフォーム^注４）が報告されており、複雑な転写調節を受けています。これまでに、ジストロフィン遺伝子の小さな領域を欠損する患者ではエクソンスキッピング法^注５）などで遺伝子治療が実施されていますが、一部の患者でしかこの方法は利用できませんでした。一方で、２．４Ｍｂの巨大遺伝子を運ぶことのできるベクターが存在しないことから、これまではジストロフィン遺伝子の一部（ミニジストロフィン）を導入する遺伝子治療がモデル動物を用いて試みられてきました。この従来のミニジストロフィンを運ぶベクターでは、完全に遺伝子を修復することが困難で、過剰に発現したり発現が消失したりする上に、上述の複数のスプライシングアイソフォームを発現させることは不可能でした。また、ベクターが患者のゲノムに挿入されることなどにより、がんを引き起こす可能性もあります。従って、細胞のゲノムに挿入されないで、ジストロフィン遺伝子全長を運ぶベクターの開発が期待されていました。

また、ヒトにおいてドナー細胞を移植する際の最大の障壁は、主要組織適合遺伝子複合体^注６）の違いであることから、自己細胞由来のｉＰＳ細胞を用いてｅｘ ｖｉｖｏ細胞遺伝子治療（生体外で細胞を治療して生体に細胞を戻す治療）が新たな治療策になると考えられます。鳥取大学ではこれまで、染色体工学技術を利用して巨大な遺伝子を染色体レベルで搭載可能な、ゲノムに挿入されないヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターの開発を行い、ヒトジストロフィン遺伝子（２．４Ｍｂ）搭載したＨＡＣベクター（ＤＹＳ-ＨＡＣ）を開発してきました。

＜研究の内容＞

本研究グループは今回、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者とそのマウスモデル由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を作製し、それぞれにＤＹＳ-ＨＡＣを微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ）^注７）を用いて導入することで、巨大な遺伝子欠損を患者由来のｉＰＳ細胞において完全に修復することに成功しました。研究の全体像は図１の通りですが、今回はステップ２とステップ３の一部について成功しています。

具体的には、以下のことが明らかとなりました。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルマウス（ｍｄｘマウス）においては、

1. １） 線維芽細胞からｉＰＳ細胞を誘導し、ＤＹＳ-ＨＡＣをＭＭＣＴにて導入することができました。またその際、ＤＹＳ-ＨＡＣは、ｍｄｘマウスｉＰＳ細胞由来のゲノムに挿入されていませんでした。
2. ２） そのｉＰＳ細胞を免疫不全マウスの皮下に移植すると、さまざまな組織を含む奇形腫が作製され、その中の筋肉細胞ではｍｄｘマウスで欠損しているジストロフィンたんぱく質の発現が観察されました。
3. ３） 上記ｉＰＳ細胞からキメラマウスを作製したところ、その各組織でＤＹＳ-ＨＡＣが高頻度に保持されており、ジストロフィン遺伝子の組織特異的なアイソフォーム^注４）も発現していました。筋肉においては、正常のヒトと同様に、細胞膜周辺にジストロフィンたんぱく質が局在していました。

またデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者においては、

1. ４） 患者由来の線維芽細胞にＤＹＳ-ＨＡＣを導入し、患者で欠損している遺伝子部位を修復できました（図２ａ）。また、遺伝子を修復した患者由来の線維芽細胞から、ｉＰＳ細胞を誘導できました（図２ｂ）。
2. ５） その遺伝子修復した患者ｉＰＳ細胞を免疫不全マウスの精巣に移植すると、さまざまな組織を含む奇形腫が作製され、その中の筋肉細胞では、患者で欠損しているジストロフィンたんぱく質が発現していました（図３ｃ）。

以上のことから、ヒトおよびマウスにおいて、ＨＡＣベクターとｉＰＳ細胞を用いることで、ジストロフィン遺伝子の修復を証明することができました。またマウスにおいては、キメラマウスの作製により、実際の生体の中でジストロフィンたんぱく質を発現させることができることを実証したことになります。

＜今後の展開＞

本研究成果は日本発のＨＡＣ技術（押村研究室）とｉＰＳ技術（山中研究室）の融合により、世界をリードする遺伝子・再生医療のための新規治療戦略の第一歩と言えます。

今回は奇形腫作製によって、筋肉細胞を作製しましたが、実際の遺伝子治療の際には、試験管内や培養皿の上などで遺伝子修復した患者ｉＰＳ細胞を筋肉細胞に分化誘導して、治療に用いる必要があります。その方法はすでに世界の研究者が成功しているので、今回の遺伝子修復方法と分化誘導方法を組み合わせれば、遺伝子治療が可能になっていくものと考えています。

なお、本研究で用いたＨＡＣベクターは、従来の遺伝子導入ベクターにはない以下のような多くの特徴を備えています（図４）。

1. １） 全ての遺伝子を取り除いてあり、どのような遺伝子でも搭載できます。
2. ２） 宿主染色体に挿入されず独立して維持されます（レトロウィルスベクターなどと比較して宿主染色体に組み込まれません）。
3. ３） 一定のコピー数で長期間安定して保持されます（過剰発現、発現消失の懸念がありません）。
4. ４） 導入可能なＤＮＡの長さの制限がありません（正常な発現制御を保証するＤＮＡエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能）。
5. ５） 導入したＨＡＣベクターを細胞から除去できます。

上述のＨＡＣベクターの利点を活かして、がん化の危険性がない安全な患者由来ｉＰＳ細胞を作製し、そのｉＰＳ細胞に、さらに治療用遺伝子、分化誘導用遺伝子、分化細胞分取用遺伝子を搭載したＨＡＣベクターを導入し、遺伝子治療・再生医療に役立てることが可能になると考えられます。特に、このＨＡＣベクターは宿主染色体に組み込まれないため、細胞から除去もできます。

また、そのほかの巨大遺伝子原因疾患や遺伝子変異部位未知の疾患の遺伝子治療の試みにも応用可能であるだけでなく、組織特異的な細胞分化や効率的な分化細胞の分取にも応用可能なことから、従来のベクター系・細胞系に相補的かつ独創的な汎用性の高い遺伝子・再生治療モデル系の構築成果が得られることが期待されます。

＜参考図＞

＜用語解説＞

注１） 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced pluripotent stem cell）

体細胞へ数種類の遺伝子などを導入することによって作製される細胞で、ＥＳ細胞のように高い増殖能とさまざまな細胞へと分化できる分化多能性を持つ。患者由来の細胞からも誘導できることから、遺伝子医療・再生医療に利用できるものと期待されている。

注２） ヒト人工染色体（ＨＡＣ：human artificial chromosome）

人工的に構築した極小の染色体であり、さまざまな遺伝子が搭載できる。ヒト人工染色体の作製方法には、染色体構造に必要な部品を集めたボトムアップ型と、元からある染色体を改変して作製するトップダウン型の２つがある。今回用いたのは、後者である。

注３） Ｍｂ（メガベース）

１Ｍｂは１００万個の塩基を指す。通常のプラスミドベクターやウイルスベクターで運べるサイズは数Ｋｂ（数千個の塩基）程度である。ＨＡＣベクターを用いることで、サイズに制約なく、遺伝子を運ぶことができる。ジストロフィンはヒトの中で最大の大きさの遺伝子で２．４Ｍｂある。

注４） アイソフォーム、スプライシングアイソフォーム

多くの遺伝子では１つのゲノムから複数のＲＮＡが転写され、複数の構造類似たんぱく質が作られる。この構造類似たんぱく質のことをアイソフォームまたはスプライシングアイソフォームと呼ぶ。しかし、中には構造が類似にもかかわらず異なる場所で発現したり、機能がことなることがあることから最近、ゲノムでの遺伝子導入が大切であることが指摘されている。

注５） エクソンスキッピング法

デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の中には遺伝子の点変異やエクソンの欠損により、遺伝子の読み枠のずれが生じてジストロフィン遺伝子が機能しなくなる。特別な遺伝子配列（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を導入することで、翻訳時に読み枠を欠失（スキップ）させることでジストロフィン遺伝子を機能させる方法。

注６） 主要組織適合遺伝子複合体

免疫系において重要な役割を担っている主要組織適合抗原をコードする一連の遺伝子領域。ヒトの場合は、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ：Human Leukocyte Antigen)という。

注７） 微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ：microcell-mediated chromosome transfer）

優性選択マーカーでマークした染色体を保持する細胞にコルセミド処理を行い、サイトカラシンや遠心分離を行うことでマークした染色体を取り出し、細胞融合を行うことで、任意の染色体を目的の細胞に導入する方法。

＜論文名＞

“Complete genetic correction of iPS cells from Duchenne muscular dystrophy”
（デュシェンヌ型筋ジストロフィー由来のｉＰＳ細胞における完全な遺伝子の修復）
doi: 10.1038/mt.2009.274

＜お問い合わせ先＞

＜研究に関すること＞

押村 光雄（オシムラ ミツオ）
鳥取大学 大学院医学系研究科　機能再生医科学専攻　教授
〒683-8503 鳥取県米子市西町８６
Tel：0859-38-6212　Fax：0859-38-6210
E-mail：

香月 康宏（カヅキ ヤスヒロ）
鳥取大学 大学院医学系研究科　機能再生医科学専攻　助教
〒683-8503 鳥取県米子市西町８６
Tel：0859-38-6412　Fax：0859-38-6210
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